Szczegółowe sposoby postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum.

ROZPORZĄDZENIE

MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI¹⁾

z dnia 13 kwietnia 2004 r.

w sprawie szczegółowych sposobów postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum²⁾

Na podstawie art. 10 ust. 1 ustawy z dnia 18 grudnia 2003 r. o ochronie roślin (Dz. U. z 2004 r. Nr 11, poz. 94) zarządza się, co następuje:

§ 1. Rozporządzenie określa szczegółowe sposoby postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum, powodującej chorobę zwaną śluzakiem, w celu jej zlokalizowania i określenia rozprzestrzenienia, niedopuszczenia do jej wystąpienia i rozprzestrzenienia oraz zwalczenia i zniszczenia tej bakterii, w tym:

1) metody zwalczania i zapobiegania rozprzestrzenianiu się;

2) metody wykrywania i identyfikacji;

3) sposób wyznaczania stref, w których powinny być stosowane środki w celu zwalczania lub zapobiegania rozprzestrzenianiu się bakterii;

4) warunki prowadzenia produkcji, obrotu, przemieszczania, przechowania, nabywania lub zbywania roślin.

§ 2. Użyte w rozporządzeniu określenia oznaczają:

1) sadzenie - każdą czynność mającą na celu umieszczenie roślin w sposób umożliwiający ich wzrost, reprodukcję lub rozmnożenie;

2) rośliny przeznaczone do sadzenia:

a) rośliny już posadzone, które mają pozostać w podłożu uprawowym lub być przesadzone, lub

b) rośliny nieposadzone w chwili wprowadzania do obrotu lub przemieszczania, lecz przeznaczone do późniejszego sadzenia;

3) urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka - sadzeniaki ziemniaka uznane w urzędowej ocenie za elitarne lub kwalifikowane;

4) miejsce produkcji - wszelkie obiekty, w szczególności magazyny, przechowalnie, szklarnie, tunele foliowe lub pola znajdujące się w obrębie jednego gospodarstwa lub jego części, lub w obrębie kilku gospodarstw, stanowiące jedną zorganizowaną całość;

5) sadzeniaki ziemniaka - ziemniaki przeznaczone do sadzenia, pochodzące w linii prostej z materiału uzyskanego według urzędowo zatwierdzonego programu, w którym materiał uznano za wolny od organizmów szkodliwych w wyniku badań urzędowych lub nadzorowanych z urzędu, wykonanych z zastosowaniem metody określonej w załączniku do rozporządzenia.

§ 3. Kontroli mającej na celu sprawdzenie występowania bakterii Ralstonia solanacearum, zwanej dalej "kontrolą urzędową", podlegają:

1) rośliny ziemniaka (Solanum tuberosum), w tym bulwy, z wyjątkiem nasion;

2) rośliny pomidora (Lycopersicon esculentum), z wyjątkiem owoców i nasion;

3) miejsca produkcji roślin, o których mowa w pkt 1 i 2, jeżeli istnieje ryzyko rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum;

4) inne rośliny żywicielskie wraz z dziko rosnącymi roślinami psiankowatymi;

5) wody powierzchniowe wykorzystywane do nawadniania lub oprysków roślin wymienionych w pkt 1 i 2;

6) płynne resztki powstające w czasie procesów przemysłowych lub w miejscach pakowania roślin, o których mowa w pkt 1 i 2, wykorzystywane do nawadniania lub oprysków tych roślin;

7) podłoża uprawowe, gleba i resztki stałe powstające w czasie procesów przemysłowych lub w miejscach pakowania roślin, jeżeli istnieje ryzyko rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum.

§  4. 

1. Kontrole urzędowe wojewódzki inspektor ochrony roślin i nasiennictwa, zwany dalej "wojewódzkim inspektorem", przeprowadza w zakresach i terminach uwzględniających systemy produkcji roślin ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum oraz biologię tej bakterii, a także wiedzę naukową w tym zakresie.

2. Kontrole urzędowe obejmują, w przypadku:

1) ziemniaka:

a) wizualną inspekcję uprawy roślin,

b) pobieranie prób, zarówno ziemniaków sadzeniaków, jak i innych ziemniaków, w czasie sezonu uprawy lub w przechowalni,

c) ocenę makroskopową bulw po ich przekrojeniu,

d) badanie laboratoryjne ziemniaków sadzeniaków, z zastosowaniem metodyki określonej w załączniku do rozporządzenia;

2) pomidora - przynajmniej wizualną inspekcję roślin, które są przeznaczone do sadzenia przez podmioty zawodowo trudniące się uprawą pomidorów;

3) innych roślin żywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum oraz podłoży, wody i resztek powstających w czasie procesów przemysłowych lub w miejscach pakowania roślin ziemniaka lub pomidora, lub innych roślin żywicielskich:

a) wizualną inspekcję roślin,

b) pobieranie i badanie prób.

§ 5. W przypadku podejrzenia wystąpienia bakterii Ralstonia solanacearum, wojewódzki inspektor przeprowadza badanie laboratoryjne:

1) roślin ziemniaka i pomidora - z zastosowaniem metodyki określonej w załączniku do rozporządzenia;

2) innych roślin żywicielskich oraz wód powierzchniowych, płynnych i stałych resztek powstających w czasie procesów przemysłowych lub w miejscach pakowania roślin ziemniaka, pomidora i innych roślin żywicielskich, a także podłoży uprawowych i gleby - z zastosowaniem uznanych metod badawczych.

§ 6. Do czasu zakończenia badań laboratoryjnych mających na celu potwierdzenie lub wykluczenie porażenia roślin przez bakterię Ralstonia solanacearum, zabezpiecza się i przechowuje:

1) partię materiału roślinnego lub jej część, z której pobrano próbę, w oryginalnym opakowaniu wraz z etykietą;

2) pozostałą część próby, o której mowa w pkt 1, jeżeli to możliwe;

3) pozostały ekstrakt i dodatkowy materiał przygotowany do wstępnych badań umożliwiających postawienie wstępnej diagnozy;

4) całą dokumentację dotyczącą pobrania próby i badań.

§  7. 

1. W przypadku podejrzenia wystąpienia lub w przypadku potwierdzenia w czasie badań laboratoryjnych występowania bakterii Ralstonia solanacearum, Główny Inspektor Ochrony Roślin i Nasiennictwa powiadamia o tym Komisję Europejską i inne państwa członkowskie Unii Europejskiej.

2. W przypadku potwierdzenia w czasie badań laboratoryjnych występowania bakterii Ralstonia solanacearum, przez co najmniej miesiąc od dnia powiadomienia, o którym mowa w ust. 1, zabezpiecza się i przechowuje:

1) cały materiał dotyczący pobrania próby i badań wraz z dokumentacją, o których mowa w § 6;

2) próbę porażonego materiału roślinnego pomidora lub oberżyny, zainokulowanego ekstraktem z bulw lub roślin, jeżeli to możliwe;

3) wyizolowaną kulturę bakterii Ralstonia solanacearum.

§ 8. W przypadku pobrania prób do badań laboratoryjnych lub w przypadku podejrzenia wystąpienia porażenia przez bakterię Ralstonia solanacearum, jeżeli widoczne są objawy choroby, o których mowa w załączniku do rozporządzenia w części II, wywoływanej przez tę bakterię, i otrzymano pozytywny wynik po przeprowadzeniu wstępnych badań określonych w załączniku do rozporządzenia w części I w ust. 1 i w części II albo jeżeli objawy choroby nie są widoczne, a otrzymano pozytywny wynik po przeprowadzeniu badań określonych w załączniku do rozporządzenia w części I w ust. 2 i w części III, do czasu uzyskania wyników potwierdzających lub wykluczających obecność bakterii Ralstonia solanacearum:

1) nie przemieszcza się roślin lub bulw pochodzących ze wszystkich upraw, partii roślin lub przesyłek, z których pobrano próby, chyba że przemieszczanie to odbywa się pod nadzorem wojewódzkiego inspektora i jeżeli nie istnieje ryzyko rozprzestrzenienia się bakterii Ralstonia solanacearum;

2) rośliny pochodzące z upraw, partii roślin lub przesyłek, z których pobrano próby, nie mogą być przeznaczone do sadzenia i nie mogą być w czasie zbioru, transportu lub przechowywania, mieszane z innymi partiami roślin;

3) wojewódzki inspektor:

a) podejmuje czynności mające na celu wykrycie źródła pochodzenia prawdopodobnego porażenia,

b) może wprowadzić inne, niż określone w pkt 1 i 2, działania zapobiegające rozprzestrzenianiu się bakterii Ralstonia solanacearum.

§ 9. Jeżeli w badaniach laboratoryjnych, przeprowadzonych z zastosowaniem metodyki określonej w załączniku do rozporządzenia, zostanie potwierdzona obecność bakterii Ralstonia solanacearum w próbie, wojewódzki inspektor:

1) w przypadku roślin ziemniaka, w tym bulw ziemniaka, lub roślin pomidora:

a) ustala zasięg i pierwotne źródła porażenia, zgodnie z § 10, oraz przeprowadza badania co najmniej wszystkich rozmnożeń klonalnych sadzeniaków ziemniaka,

b) uznaje za porażone rośliny, przesyłkę lub partię roślin ziemniaka lub pomidora, z których pobierane były próby,

c) uznaje za skażone maszyny, urządzenia, pojazdy, pojemniki, magazyny lub ich części, materiały używane do pakowania i inne przedmioty, które miały kontakt z porażonymi roślinami ziemniaka lub pomidora,

d) uznaje za porażone pola, miejsca uprawy pod osłonami i miejsca produkcji, w których rosły lub odbywały się zbiory porażonych roślin ziemniaka lub pomidora, jeżeli ma to zastosowanie,

e) ustala zasięg prawdopodobnego porażenia, zgodnie z § 11, biorąc pod uwagę: kontakt z porażonymi roślinami ziemniaka lub pomidora przed zbiorami lub po zbiorach, kontakt ze skażonymi maszynami, urządzeniami, pojazdami, pojemnikami, magazynami lub ich częściami, materiałami używanymi do pakowania, o których mowa w lit. c, oraz kontakt z porażonym polem, miejscem uprawy pod osłonami lub miejscem produkcji, o których mowa w lit. d, a także powiązania produkcyjne, nawadnianie lub spryskiwanie, lub pokrewieństwo klonalne,

f) ustala zasięg możliwego rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum, zgodnie z § 12,

g) na podstawie stwierdzonego porażenia i skażenia, określonego zasięgu prawdopodobnego porażenia i możliwego rozprzestrzeniania się bakterii wyznacza strefę, w której podejmowane będą działania w celu zwalczania i zapobiegania rozprzestrzenianiu się bakterii Ralstonia solanacearum, zwaną dalej "strefą zagrożenia";

2) w przypadku upraw innych roślin żywicielskich, jeżeli uprawa roślin ziemniaka lub pomidora została uznana za zagrożoną:

a) ustala zasięg i pierwotne źródła porażenia oraz przeprowadza testy na co najmniej wszystkich rozmnożeniach klonalnych sadzeniaków ziemniaka,

b) określa jako porażone przez bakterię Ralstonia solanacearum te rośliny żywicielskie, z których pobrano próby,

c) określa prawdopodobne porażenie i skażenie oraz wyznacza strefę zagrożenia, biorąc pod uwagę powiązania produkcyjne roślin ziemniaka lub pomidora;

3) w przypadku wód powierzchniowych lub płynnych resztek powstających w czasie procesów przemysłowych lub w miejscach pakowania roślin ziemniaka lub pomidora oraz związanych z nimi dziko rosnących roślin żywicielskich z rodziny psiankowatych, jeżeli istnieje zagrożenie dla produkcji roślin ziemniaka lub pomidora w związku z nawadnianiem, opryskiwaniem lub zalewaniem wodami powierzchniowymi:

a) ustala zasięg porażenia po przeprowadzeniu urzędowego badania prób tych wód, resztek płynnych lub dziko rosnących roślin żywicielskich z rodziny psiankowatych, jeżeli one występują,

b) określa jako skażone wody powierzchniowe, z których pobrano próby, na podstawie wyników badania, o którym mowa w lit. a,

c) określa prawdopodobne porażenie i skażenie oraz wyznacza strefę zagrożenia.

§ 10. Badania mające na celu ustalenie zasięgu i pierwotnego źródła porażenia obejmują:

1) miejsca produkcji, w których:

a) są lub były uprawiane rośliny ziemniaka pochodzące z tego samego rozmnożenia klonalnego, co rośliny ziemniaka uznane za porażone przez bakterię Ralstonia solanacearum,

b) są lub były uprawiane rośliny pomidora pochodzące z tego samego źródła, co rośliny pomidora uznane za porażone przez bakterię Ralstonia solanacearum,

c) są lub były uprawiane rośliny ziemniaka lub pomidora, które zostały poddane urzędowemu nadzorowi, ze względu na podejrzenie wystąpienia bakterii Ralstonia solanacearum,

d) są lub były uprawiane rośliny ziemniaka pochodzące z tego samego rozmnożenia klonalnego, co rośliny ziemniaka uprawiane w miejscach produkcji uznanych za porażone przez bakterię Ralstonia solanacearum,

e) są lub były uprawiane rośliny ziemniaka lub pomidora, a miejsce ich uprawy położone jest lub było w sąsiedztwie porażonych miejsc produkcji, wraz z miejscami produkcji, w których wspólnie użytkowany jest lub był sprzęt i urządzenia używane w produkcji,

f) do nawadniania lub opryskiwania używa się wód powierzchniowych pochodzących:

– z jakiegokolwiek źródła, które zostało uznane za skażone lub podejrzane o skażenie bakterią Ralstonia solanacearum,

– ze źródła użytkowanego także w miejscach produkcji uznanych za porażone lub podejrzane o porażenie bakterią Ralstonia solanacearum,

g) pola są lub były zalewane przez wody powierzchniowe uznane za skażone lub podejrzane o skażenie przez bakterię Ralstonia solanacearum;

2) wody powierzchniowe używane do nawadniania lub opryskiwania lub, które zalewają pola lub miejsca produkcji, uznane za porażone albo podejrzane o porażenie bakterią Ralstonia solanacearum.

§ 11. Badania mające na celu ustalenie zasięgu prawdopodobnego porażenia obejmują:

1) inne rośliny ziemniaka lub pomidora, uprawiane w miejscu produkcji określonym jako porażone;

2) miejsca produkcji, które miały jakikolwiek kontakt z roślinami ziemniaka lub pomidora określonymi jako porażone, wraz z miejscami produkcji, w których wspólnie użytkowany jest lub był sprzęt i urządzenia używane w cyklu produkcyjnym;

3) rośliny ziemniaka lub pomidora produkowane w miejscach produkcji, o których mowa w pkt 2;

4) rośliny ziemniaka lub pomidora znajdujące się w miejscach produkcji, o których mowa w pkt 1 lub 2, w okresie, w którym rośliny ziemniaka lub pomidora, uznane za porażone, znajdowały się w miejscach produkcji określonych jako porażone;

5) miejsca przechowywania roślin ziemniaka lub pomidora pochodzących z miejsc produkcji wymienionych w pkt 1-4;

6) maszyny, urządzenia, pojazdy, pojemniki, magazyny lub ich części, materiały używane do pakowania i inne przedmioty, które mogły mieć kontakt z roślinami ziemniaka lub pomidora uznanymi za porażone;

7) rośliny ziemniaka lub pomidora przechowywane lub mające kontakt z jakimikolwiek obiektami lub przedmiotami, o których mowa w pkt 6, przed ich wyczyszczeniem i zdezynfekowaniem;

8) rośliny, w tym bulwy ziemniaka, określone zgodnie § 9 pkt 1 lit. a, pochodzące z tego samego rozmnożenia klonalnego lub rośliny pomidora pochodzące z tego samego źródła, co rośliny ziemniaka lub pomidora uznane za porażone, jeżeli istnieje prawdopodobieństwo porażenia ze względu na pokrewieństwo klonalne, pomimo uzyskania negatywnych wyników badań;

9) miejsca produkcji roślin ziemniaka lub pomidora, o których mowa w pkt 8;

10) miejsca produkcji roślin ziemniaka lub pomidora, w których do nawadniania i opryskiwania używana była woda uznana za skażoną;

11) rośliny ziemniaka lub pomidora produkowane na polach zalewanych wodami powierzchniowymi uznanymi za skażone.

§ 12. Badania mające na celu ustalenie zasięgu możliwego rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum obejmują:

1) w przypadkach gdy rośliny ziemniaka lub pomidora zostały uznane za porażone - miejsca produkcji, w których:

a) są lub były uprawiane rośliny ziemniaka lub pomidora, znajdujące się w sąsiedztwie miejsc produkcji uznanych za porażone,

b) stosowana jest lub była wspólna produkcja i używany jest lub był ten sam materiał wyjściowy sadzeniaka ziemniaka,

c) do nawadniania lub opryskiwania roślin ziemniaka lub pomidora używa się wód powierzchniowych, które pochodziły z miejsca produkcji uznanego za porażone, lub jeżeli istnieje ryzyko, że wody te spłynęły lub zalewały te miejsca;

2) w przypadkach gdy wody powierzchniowe zostały uznane za skażone:

a) miejsca produkcji roślin ziemniaka lub pomidora, znajdujące się w sąsiedztwie zbiornika wód powierzchniowych uznanych za skażone lub zagrożone zalaniem przez takie wody,

b) jakikolwiek odosobniony zbiornik irygacyjny połączony z wodami powierzchniowymi uznanymi za skażone.

§  13. 

1. Rośliny ziemniaka lub pomidora uznane za porażone nie mogą być sadzone.

2. Rośliny, o których mowa w ust. 1, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora powinny być:

1) spalone lub

2) zużyte do skarmiania zwierząt, po uprzednim przeprowadzeniu zabiegu termicznego, wykluczającego ryzyko przeżycia bakterii Ralstonia solanacearum, lub

3) głęboko zakopanie w miejscu, w którym nie istnieje ryzyko ich przenikania do obszarów rolniczych lub ryzyko kontaktu ze źródłem wody, która może zostać użyta do nawadniania obszarów rolniczych, lub

4) przeznaczone do przerobu przemysłowego, po bezpośrednim i natychmiastowym dostarczeniu ich do zakładu przetwórczego, spełniającego warunki określone w § 15, lub

5) poddane innym działaniom, niż wymienione w pkt 1-4, jeżeli nie istnieje ryzyko rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum.

§  14. 

1. Rośliny ziemniaka lub pomidora uznane za prawdopodobnie porażone lub rośliny ziemniaka oraz pomidora, dla których zostało zidentyfikowane ryzyko porażenia, oraz produkowane w miejscach produkcji uznanych za prawdopodobnie porażone nie mogą być sadzone.

2. Rośliny, o których mowa w ust. 1, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora powinny być:

1) w przypadku bulw ziemniaka:

a) przeznaczone do konsumpcji, pakowane w miejscach, w których istnieją odpowiednie warunki usuwania resztek, gotowe i przeznaczone do bezpośredniego dostarczenia i użycia bez przepakowywania, lub

b) przeznaczone do przerobu przemysłowego po bezpośrednim i natychmiastowym dostarczeniu ich do zakładu przetwórczego, o którym mowa w § 13 ust. 2 pkt 4, lub

c) zużyte lub usunięte w sposób określony przez wojewódzkiego inspektora, jeżeli nie istnieje ryzyko rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum;

2) w przypadku innych części roślin ziemniaka lub pomidora, wraz z resztkami łodyg i liści:

a) zniszczone lub

b) zużyte lub usunięte w sposób określony przez wojewódzkiego inspektora, jeżeli nie istnieje ryzyko rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum.

§ 15. W zakładach przetwórczych i w miejscach pakowania roślin ziemniaka lub pomidora:

1) resztki roślin ziemniaka lub pomidora oraz inne stałe resztki niszczy się przez:

a) głębokie zakopanie w miejscu, w którym nie istnieje ryzyko ich przenikania do obszarów rolniczych lub ryzyko kontaktu ze źródłem wody, która może zostać użyta do nawadniania obszarów rolniczych; resztki powinny być przewiezione bezpośrednio do tego miejsca w warunkach wykluczających ryzyko ich rozniesienia się, lub

b) spalenie;

2) resztki płynne, zawierające zawieszone cząstki stałe, poddaje się filtrowaniu lub procesowi osiadania w celu usunięcia tych cząstek, a cząstki niszczy się w sposób określony w pkt 1 lit. a; następnie resztki płynne:

a) podgrzewa się do temperatury minimum 70 °C przez co najmniej 30 minut lub

b) niszczy się w sposób zatwierdzony przez wojewódzkiego inspektora, tak aby nie istniało ryzyko kontaktu tych resztek z obszarami rolniczymi lub ryzyko kontaktu ze źródłem wody, która może zostać użyta do nawadniania obszarów rolniczych.

§ 16. Środki transportu, maszyny, urządzenia, pojazdy, pojemniki, magazyny lub ich części, materiały używane do pakowania i inne przedmioty, które zostały uznane za skażone albo za prawdopodobnie skażone, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora niszczy się albo odkaża przez oczyszczenie lub dezynfekcję w taki sposób, aby:

1) uniemożliwić rozprzestrzenienie się bakterii Ralstonia solanacearum;

2) po zabiegach mogły być uznane za nieskażone.

§  17. 

1. W obrębie wyznaczonej strefy zagrożenia podejmuje się następujące działania:

1) w miejscach produkcji określonych jako porażone, na polu lub w miejscu uprawy pod osłonami uznanym za porażone:

a) przez okres co najmniej czterech lat uprawy następujących po stwierdzeniu porażenia:

– niszczy się samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roślin żywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, z uwzględnieniem chwastów z rodziny psiankowatych,

– zakazuje się sadzenia: bulw lub roślin ziemniaka, roślin i nasion pomidora, innych roślin żywicielskich, roślin rodzaju Brassica, dla których stwierdzono ryzyko przeżywania bakterii Ralstonia solanacearum, oraz innych roślin, w przypadku których stwierdzono ryzyko rozprzestrzeniania się tej bakterii,

b) dopuszcza się sadzenie urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka, z przeznaczeniem wyłącznie na ziemniaki inne niż sadzeniaki, w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym po okresie czteroletnim, o którym mowa w lit. a, jeżeli przez co najmniej dwa kolejne ostatnie lata uprawy przed posadzeniem stwierdzano, że pole jest wolne od samosiewów ziemniaka i pomidora oraz innych roślin żywicielskich, z uwzględnieniem chwastów z rodziny psiankowatych; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach, w ramach przeprowadzanej kontroli, pobiera również próby bulw ziemniaka do badań laboratoryjnych,

c) w sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora następującym po sezonie, o którym mowa w lit. b, i po odpowiednim cyklu zmianowania, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych niż sadzeniaki, używa się urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach, w ramach przeprowadzanej kontroli, pobiera również próby bulw ziemniaka do badań laboratoryjnych, albo

2) w miejscach produkcji uznanych za porażone, na polu lub w miejscu uprawy pod osłonami uznanym za porażone:

a) przez okres pięciu lat uprawy następujących po stwierdzeniu porażenia niszczy się samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roślin żywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, z uwzględnieniem chwastów z rodziny psiankowatych,

b) przez pierwsze trzy lata uprawy pole należy:

– pozostawić odłogiem lub obsiać zbożem albo

– przeznaczyć na stałe pastwisko z częstym niskim koszeniem lub pod intensywny wypas, albo

– przeznaczyć na produkcję nasienną traw,

a przez następne dwa lata przeznaczyć na uprawę roślin niebędących żywicielami bakterii Ralstonia solanacearum, dla których nie stwierdzono ryzyka jej przeżywania lub rozprzestrzeniania się,

c) w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora następującym po okresie pięcioletnim, o którym mowa w lit. b, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych niż sadzeniaki, używa się urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach pobiera również próby bulw ziemniaka do badań laboratoryjnych;

3) na innych polach:

a) w roku uprawy następującym po stwierdzeniu porażenia:

– nie sadzi się bulw lub roślin ziemniaka, jak również innych roślin żywicielskich,

– niszczy się samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roślin żywicielskich, z uwzględnieniem chwastów z rodziny psiankowatych, lub

– dopuszcza się sadzenie urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka z przeznaczeniem na ziemniaki konsumpcyjne lub przemysłowe pod warunkiem, że nie istnieje ryzyko występowania samosiewów ziemniaka lub pomidora oraz innych roślin żywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, z uwzględnieniem chwastów z rodziny psiankowatych; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który pobiera również próby bulw ziemniaka i próby samosiewów ziemniaka do badań laboratoryjnych,

b) w pierwszym roku uprawy następującym po roku, o którym mowa w lit. a, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych niż sadzeniaki, używa się urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka,

c) w co najmniej drugim roku uprawy następującym po roku, o którym mowa w lit. a, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych niż sadzeniaki, używa się urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka lub sadzeniaków ziemniaka wyprodukowanych pod nadzorem wojewódzkiego inspektora z urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka,

d) w każdym roku uprawy, o których mowa w lit. a-c, niszczy się samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roślin żywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, z uwzględnieniem chwastów z rodziny psiankowatych; uprawa przeznaczona na sadzeniaki ziemniaka podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach pobiera również próby bulw ziemniaka do badań laboratoryjnych;

4) bezpośrednio po stwierdzeniu porażenia oraz w każdym następnym roku uprawy, aż do pierwszego sezonu włącznie, w którym na polach uznanych za porażone dopuszcza się uprawę ziemniaków lub pomidorów:

a) maszyny i miejsca przechowywania roślin, produktów roślinnych lub przedmiotów w miejscu produkcji, wykorzystywane do produkcji ziemniaka lub pomidora, czyści się i dezynfekuje w sposób uniemożliwiający rozprzestrzenianie się bakterii Ralstonia solanacearum,

b) wojewódzki inspektor przeprowadza kontrolę programów nawadniania i opryskiwania, jeżeli istnieje ryzyko rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum;

5) w miejscu uprawy pod osłonami uznanym za porażone, w którym możliwa jest całkowita wymiana gleby lub podłoża:

a) nie uprawia się bulw i roślin ziemniaka, roślin i nasion pomidora oraz innych roślin żywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, do czasu stwierdzenia przez wojewódzkiego inspektora, że w wyniku przeprowadzonych zabiegów, w tym co najmniej usunięcia wszelkiego materiału roślin żywicielskich, całkowitej wymiany podłoża oraz oczyszczenia lub zdezynfekowania miejsca uprawy i całego wyposażenia, wyeliminowano tę bakterię,

b) dopuszcza się produkcję ziemniaka z urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka, minibulw lub mikroroślin, uzyskanych pod urzędowym nadzorem,

c) wojewódzki inspektor prowadzi kontrolę programów nawadniania i opryskiwania, w celu zapobieżenia rozprzestrzenianiu się bakterii Ralstonia solanacearum.

2. W obrębie strefy zagrożenia, oprócz wymagań określonych w ust. 1:

1) w przypadku gdy strefa zagrożenia została wyznaczona zgodnie z § 9 pkt 1 lit. g, bezpośrednio po stwierdzeniu porażenia i przez okres co najmniej trzech lat uprawy po stwierdzeniu porażenia:

a) wojewódzki inspektor sprawuje nadzór nad miejscami uprawy, przechowywania i miejscami mającymi kontakt z bulwami ziemniaka lub pomidorami, wraz z miejscami, w których wspólnie użytkowane są maszyny do produkcji ziemniaka lub pomidora,

b) prowadzi się czyszczenie lub dezynfekcję maszyn i miejsc przechowywania w sposób uniemożliwiający rozprzestrzenianie się bakterii Ralstonia solanacearum,

c) w przypadku upraw ziemniaka, dopuszcza się sadzenie wyłącznie urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka lub sadzeniaków ziemniaka wyprodukowanych pod nadzorem wojewódzkiego inspektora z urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach pobiera do badań laboratoryjnych próby bulw ziemniaka sadzeniaka z miejsc produkcji prawdopodobnie porażonych,

d) oddziela się czynności związane ze zbiorem, przechowywaniem, przemieszczaniem i pakowaniem zebranych sadzeniaków ziemniaka od takich czynności wykonywanych przy ziemniakach innych niż sadzeniaki, na terenie wszystkich miejsc w obrębie strefy zagrożenia,

e) wojewódzki inspektor przeprowadza kontrole urzędowe;

2) w przypadku gdy wody powierzchniowe zostały uznane za skażone lub za drogę możliwego rozprzestrzenienia się bakterii Ralstonia solanacearum, wojewódzki inspektor, bezpośrednio po stwierdzeniu skażenia i przez okres co najmniej trzech lat uprawy po stwierdzeniu skażenia, przeprowadza:

a) coroczne kontrole obejmujące pobieranie do badań laboratoryjnych prób wód powierzchniowych i roślin żywicielskich z rodziny psiankowatych, rosnących w sąsiedztwie tych wód, w terminach umożliwiających wykrycie bakterii Ralstonia solanacearum,

b) kontrolę programów nawadniania i opryskiwania, w tym w zakresie zakazu stosowania wody uznanej za skażoną do nawadniania lub opryskiwania roślin ziemniaka lub pomidora oraz innych roślin żywicielskich,

c) kontrole usuwania resztek stałych powstających w czasie procesów przemysłowych lub w miejscach pakowania, w których wykorzystywane są rośliny ziemniaka lub pomidora - w przypadku stwierdzenia skażenia resztek płynnych;

3) wojewódzki inspektor podejmuje działania zmierzające do wymiany sadzeniaków ziemniaka.

§  18. 

1. W przypadku stwierdzenia obecności bakterii Ralstonia solanacearum w ziemniakach wyprodukowanych na terytorium Rzeczypospolitej Polskiej, wojewódzki inspektor przeprowadza badania:

1) dotyczące wcześniejszych rozmnożeń ziemniaka wraz z początkowym rozmnożeniem klonalnym i rozmnożeń klonalnych materiałów bazowych sadzeniaków ziemniaka lub

2) wszystkich rozmnożeń klonalnych materiałów bazowych lub wcześniejszych rozmnożeń wraz z początkowym rozmnożeniem klonalnym, jeżeli nie stwierdzono żadnego pokrewieństwa klonów.

2. W przypadkach innych niż określone w ust. 1, wojewódzki inspektor przeprowadza badania na każdej roślinie pochodzącej z początkowego rozmnożenia klonalnego wstępnej selekcji lub na reprezentatywnej próbie pobranej z materiałów bazowych sadzeniaków ziemniaka lub z materiałów pochodzących z wcześniejszych rozmnożeń.

§ 19. Rozporządzenie wchodzi w życie z dniem ogłoszenia.

______

¹⁾ Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi kieruje działem administracji rządowej - rolnictwo, na podstawie § 1 ust. 2 pkt 1 rozporządzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 29 marca 2002 r. w sprawie szczegółowego zakresu działania Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. Nr 32, poz. 305).

²⁾ Przepisy niniejszego rozporządzenia wdrażają postanowienia dyrektywy 98/57/EEC z dnia 20 lipca 1998 r. w sprawie zwalczania Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et. al. (Dz. Urz. WE L 235, z 21.08.1998 r.).

Dane dotyczące ogłoszenia aktów prawa Unii Europejskiej, zamieszczone w niniejszym rozporządzeniu, z dniem uzyskania przez Rzeczpospolitą Polską członkostwa w Unii Europejskiej, dotyczą ogłoszenia tych aktów w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - wydanie specjalne.

ZAŁĄCZNIK

METODYKA DIAGNOZOWANIA, WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI BAKTERII Ralstonia solanacearum

I.

Zakres stosowania metodyki

Metodyka obejmuje:

1) diagnozowanie śluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka i pomidora;

2) wykrywanie i identyfikację bakterii Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka.

1. Diagnozowanie śluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka i pomidora

Metodyka ma zastosowanie do bulw ziemniaka oraz roślin ziemniaka i pomidora z charakterystycznymi objawami chorobowymi lub podejrzanych o porażenie przez bakterię Ralstonia solanacearum. Metodyka obejmuje szybkie badania umożliwiające postawienie wstępnej diagnozy, zwane dalej "metodami wstępnego badania", izolację patogena z porażonych wiązek przewodzących na podłoża diagnostyczne, a w przypadku uzyskania wyników pozytywnych - identyfikację kultury jako bakteria Ralstonia solanacearum.

Diagram postępowania diagnostycznego:

diagram

Objaśnienia do diagramu:

¹⁾ opis objawów zamieszczono w części II ust. 1.

²⁾ metodami wstępnego badania są:

- test na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi (część II ust. 2),

- test na obecność granulek poly-β-hydroksymaślanu (część II ust. 2),

- test IF (część III ust. 2),

- test ELISA (część III ust. 3),

- test PCR (część III ust. 4),

³⁾ izolacja bakterii z materiału roślinnego z typowymi objawami metodą rozcieńczeń płytkowych jest prosta, jednakże w przypadku zaawansowanych stadiów infekcji hodowla może się nie udać; bakterie saprofityczne występujące w chorej tkance mogą przerastać bakterię Ralstonia solanacearum lub hamować jej wzrost na podłożu hodowlanym; jeżeli wynik izolacji jest negatywny, a objawy chorobowe są typowe, izolację należy powtórzyć; zalecaną jest metoda posiewu na podłoża selektywne,

⁴⁾ wiarygodną identyfikację czystej kultury bakterii Ralstonia solanacearum można przeprowadzić w oparciu o testy wymienione w części II ust. 4 pkt 1 w połączeniu z testem patogeniczności (części II ust. 4 pkt 3); oznaczanie szczepu nie jest obowiązkowe, lecz zalecane w każdym nowym przypadku wykrycia bakterii Ralstonia solanacearum.

2. Wykrywanie i identyfikacja bakterii Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka

Metodyka ma zastosowanie do wykrywania infekcji latentnej w bulwach ziemniaka za pomocą jednej lub kilku metod szybkiego badania. Pozytywne wyniki badań uzyskanych z zastosowaniem tych metod są potwierdzane przez izolację bakterii Ralstonia solanacearum, a następnie, w przypadku izolacji typowych kolonii, identyfikację czystej kultury bakterii Ralstonia solanacearum.

Diagram postępowania diagnostycznego:

diagram

Objaśnienia do diagramu:

¹⁾ standardowa próba składa się z co najmniej 200 bulw pobranych z partii bulw ziemniaka o masie 25 ton, jednakże badanie można również wykonać dla mniejszych prób,

²⁾ jeżeli pojedynczy test jest niewystarczająco czuły lub zbyt mało wiarygodny do wykrycia bakterii Ralstonia solanacearum w próbie, zaleca się przeprowadzenie więcej niż jednego testu. Testy powinny opierać się na różnych zasadach biologicznych,

³⁾ test immunofluorescencji (IF) jest powszechnie przyjętą metodą wstępnego badania; w odniesieniu do parametrów określonych w tej metodzie jest to test czuły (zakres czułości 10³-10⁴ komórek/ml osadu ekstraktu ziemniaka); czynnikiem krytycznym decydującym o wiarygodności wyniku testu jest jakość przeciwciał; należy używać wyłącznie przeciwciał o wysokim mianie (minimum 2.000 dla przeciwciał wyjściowych), a wszystkie testy muszą być wykonywane z przeciwciałami w zakresie miana lub z zastosowaniem pierwszego rozcieńczenia poniżej miana; zalecana jest metoda pośrednia; metodę bezpośrednią można stosować, jeśli poziom wykrywalności i specyficzności tej metody jest równoważny z poziomem metody pośredniej; test IF umożliwia dokonanie oceny morfologii zabarwionych komórek i intensywności fluorescencji; na tej podstawie określa się specyficzność reakcji; w teście IF dość powszechne są reakcje krzyżowe z serologicznie spokrewnionymi bakteriami glebowymi lub bakteriami obecnymi w tkankach ziemniaka o morfologii komórki zbliżonej do bakterii Ralstonia solanacearum; w przypadkach podejrzenia o wystąpienie reakcji krzyżowych należy przeprowadzić badanie dodatkową metodą opartą na innej zasadzie biologicznej; w takich przypadkach zalecana jest izolacja na podłoże selektywne,

⁴⁾ metoda izolacji bakterii Ralstonia solanacearum na podłoże selektywne SMSA jest metodą wstępnego badania o wysokiej czułości i selektywności; wyniki izolacji uzyskuje się w ciągu 3-6 dni od przygotowania próby; wyhodowane bakterie można łatwo zidentyfikować; należy ostrożnie pobierać tkankę z części przystolonowej bulwy w celu uniknięcia zanieczyszczenia próby obecnymi w bulwach ziemniaka bakteriami wtórnymi, które "rywalizują" z bakterią Ralstonia solanacearum na podłożu i mogą niekorzystnie wpływać na rozwój tej bakterii; ze względu na niekorzystny wpływ składników podłoża na badany organizm niektóre szczepy mogą rosnąć słabo; metoda izolacji może być stosowana jako pojedyncza metoda wstępnego badania w przypadku, gdy uzyskano negatywny wynik badania i nie ma podejrzeń o zahamowanie wzrostu bakterii Ralstonia solanacearum przez inne bakterie; w przypadku negatywnego wyniku badania, ale gdy występuje podejrzenie o zahamowanie wzrostu bakterii Ralstonia solanacearum przez inne bakterie, próbę poddaje się dalszym badaniom z zastosowaniem innej metody, w celu potwierdzenia lub odrzucenia diagnozy; w takim przypadku zalecaną metodą jest test IF,

⁵⁾ test ELISA ma zakres czułości 10⁴-10⁵ komórek/ml osadu ekstraktu ziemniaka i częściej uzyskuje się w nim wyniki fałszywie pozytywne (reakcje krzyżowe) i fałszywie negatywne (hamujący wpływ cząsteczek fenolowych pochodzących z ekstraktu ziemniaka), dlatego test ELISA nie może być stosowany jako test pojedynczy,

⁶⁾ test PCR jest bardzo czułym testem; reakcja może być jednak zakłócana przez składniki roślinne obecne w ekstrakcie z roślin czy bulw (inhibitory), co wpływa na uzyskanie fałszywie negatywnych wyników; negatywny wpływ inhibitorów można zmniejszyć przez rozcieńczenie próbki, mając na uwadze, że jednocześnie ulega rozcieńczeniu populacja bakterii Ralstonia solanacearum; wszystkie etapy przygotowania próby i badania należy przeprowadzać z dużą ostrożnością w celu uniknięcia kontaminacji, która może przyczynić się do uzyskania wyników fałszywie pozytywnych; wyniki fałszywie pozytywne mogą również wynikać z homologii sekwencji innych organizmów; z tych powodów test PCR nie może być stosowany jako test pojedynczy,

⁷⁾ test wzbogacania polega na inkubacji prób ekstraktu ziemniaka w półselektywnym bulionie odżywczym (np. zmodyfikowany bulion SMSA) i pozwala na namnożenie bakterii Ralstonia solanacearum; obecność bakterii Ralstonia solanacearum można stwierdzić za pomocą testów: IF, ELISA i PCR; nie zaleca się wykonywania bezpośredniego posiewu z bulionu odżywczego; test ten nie może być wykorzystywany jako pojedyncza metoda wstępnego badania,

⁸⁾ test biologiczny może być stosowany do izolacji bakterii Ralstonia solanacearum z ekstraktu ziemniaka drogą selektywnego wzbogacania w roślinie żywicielskiej i można go wykonać na roślinach pomidora lub oberżyny; niezbędne jest zapewnienie korzystnych dla rozwoju bakterii Ralstonia solanacearum warunków środowiska,

⁹⁾ identyfikacji czystej kultury bakterii Ralstonia solanacearum dokonuje się za pomocą co najmniej jednego z testów wskazanych w części II ust. 4 pkt 1, w połączeniu z testem patogeniczności wskazanym w części II ust. 4 pkt 3; oznaczanie szczepu nie jest obowiązkowe, lecz zalecane w każdym nowym przypadku wykrycia bakterii.

II.

Diagnozowanie śluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka i pomidora

1. Objawy śluzaka

1.1. Objawy na ziemniaku

Na roślinach ziemniaka we wczesnym stadium infekcji obserwuje się więdnięcie liści ku wierzchołkowi łodygi w ciągu dnia, gdy panuje wysoka temperatura. Objawy te zanikają nocą. Więdnięcie szybko staje się nieodwracalne i prowadzi do śmierci rośliny. Wiązki przewodzące więdnącej rośliny, widoczne na przekroju poprzecznym przez łodygę, mogą przebarwiać się na brązowo, a z przeciętej powierzchni wycieka samoistnie lub po ściśnięciu łodygi mleczny śluz. Po umieszczeniu przeciętej łodygi w wodzie w pozycji pionowej, z wiązek przewodzących wydostają się smużki śluzu.

W bulwach ziemniaka, po poprzecznym ich przekrojeniu w pobliżu części przystolonowej, we wczesnym stadium infekcji występują szklistożółte do jasnobrązowych przebarwienia pierścienia wiązek przewodzących, z których po kilku minutach wydostaje się, samoistnie lub po lekkim ściśnięciu palcami, jasnokremowy śluz widoczny na przeciętej powierzchni. Następnie, brązowe przebarwienia wiązek stają się wyraźniejsze, a nekroza może rozszerzać się na tkankę parenchymatyczną. W zaawansowanych stadiach infekcja rozprzestrzenia się z części przystolonowej i oczek na zewnątrz, wskutek czego na powierzchni bulwy mogą występować czerwonobrązowe, lekko zapadnięte ranki, a na nich mogą pojawiać się wycieki bakteryjne, do których przylegają grudki ziemi.

1.2. Objawy na roślinach pomidora

Pierwszym widocznym objawem jest zwiotczały wygląd najmłodszych liści. W sprzyjających rozwojowi bakterii Ralstonia solanacearum warunkach środowiska (temperatura gleby około 25 °C, duża wilgotność) w ciągu kilku dni dochodzi do epinastii i jednostronnego lub całkowitego więdnięcia rośliny, a następnie jej zamierania. W mniej sprzyjających warunkach (temperatura gleby poniżej 21 °C) na łodydze może rozwijać się wiele korzeni przybyszowych. Czasami widoczne są tłuste smugi przebiegające wzdłuż łodygi, które wskazują na obecność nekroz w obrębie wiązek przewodzących. Po przekrojeniu łodygi w poprzek, ze zbrązowiałych wiązek przewodzących wyciekają krople śluzu bakteryjnego barwy białej lub żółtawej.

2. Metody wstępnego badania

W celu postawienia wstępnej diagnozy stosuje się jeden lub kilka z niżej wymienionych testów:

1) test na obecność wycieków z łodygi:

a) więdnącą łodygę ziemniaka przecina się nieco powyżej poziomu gleby,

b) odcięty fragment łodygi umieszcza się przeciętą powierzchnią w zlewce z wodą,

c) po chwili z wiązek przewodzących samoistnie wydostają się smużki śluzu bakteryjnego;

2) test na wykrywanie granulek poly-β-hydroksymaślanu (PHB):

a) granulki PHB w komórkach bakterii Ralstonia solanacearum stają się widoczne po zabarwieniu błękitem nilu A albo sudanem czarnym B,

b) wykonuje się rozmaz ze śluzu lub zawiesiny tkanki na szkiełku mikroskopowym albo przygotowuje się preparat z 48. godzinnej kultury bakterii Ralstonia solanacearum na podłożu YPGA lub SPA, o którym mowa w części IV ust. 1,

c) przygotowuje się kontrolę pozytywną w postaci rozmazu ze szczepu należącego do biowaru 2/rasa 3 oraz, w przypadku gdy to stosowne, kontrolę negatywną w postaci rozmazu z niespokrewnionego szczepu,

d) preparat suszy się, a następnie kilkakrotnie szybko przesuwa spodnią powierzchnią nad płomieniem palnika w celu utrwalenia rozmazu;

3) test z błękitem nilu:

a) utrwalony rozmaz zalewa się 1 % wodnym roztworem błękitu nilu A, a następnie inkubuje się przez 10 minut w temperaturze 55 °C,

b) zlewa się roztwór barwnika, przepłukuje słabym strumieniem wody bieżącej, a nadmiar wody usuwa za pomocą bibuły,

c) preparat zalewa się 8 % wodnym roztworem kwasu octowego i inkubuje przez minutę w temperaturze pokojowej,

d) preparat przepłukuje się słabym strumieniem wody bieżącej i osusza bibułą,

e) preparat zwilża się kroplą wody i nakłada szkiełko nakrywkowe;

f) zabarwiony rozmaz ogląda się w mikroskopie epifluorescencyjnym (450 nm) pod imersją, stosując powiększenie 1.000x; obserwacje preparatu prowadzi się w kierunku wykrycia jasnopomarańczowych, fluoryzujących granulek PHB,

g) preparat ogląda się również w świetle białym, aby upewnić się, że granulki znajdują się wewnątrz komórek bakterii, a morfologia komórki jest typowa dla bakterii Ralstonia solanacearum;

4) test z sudanem czarnym:

a) utrwalony rozmaz zalewa się 0,3 % roztworem sudanu czarnego B w 70 % alkoholu oraz inkubuje przez 10 minut w temperaturze pokojowej,

b) zlewa się roztwór barwnika i przepłukuje wodą bieżącą; nadmiar wody zlewa się, a preparat osusza za pomocą bibuły,

c) preparat zanurza się na krótko w ksylolu i osusza bibułą; z uwagi na szkodliwość ksylolu pracę wykonuje się pod digestorium,

d) preparat zalewa się 0,5 % wodnym roztworem safraniny i pozostawia na 10 sekund w temperaturze pokojowej; z uwagi na szkodliwość safraniny pracę wykonuje się pod digestorium,

e) delikatnie przepłukuje się preparat słabym strumieniem wody bieżącej, osusza bibułą i nakłada szkiełko nakrywkowe,

f) zabarwiony preparat ogląda się w mikroskopie świetlnym, w świetle przechodzącym pod imersją, stosując powiększenie 1.000x, granulki PHB w komórkach bakterii Ralstonia solanacearum barwią się na niebieskoczarno, a ściana komórkowa barwi się na różowo;

5) inne testy:

a) test IF - przeprowadzany zgodnie ze sposobem określonym w części III ust. 2,

b) test ELISA - przeprowadzany zgodnie ze sposobem określonym w części III ust. 3,

c) test PCR - przeprowadzany zgodnie ze sposobem określonym w części III 4 ust. 4.

3. Metoda izolacji

1) pobiera się śluz lub fragmenty przebarwionej tkanki z pierścienia wiązek przewodzących bulwy ziemniaka lub z wiązek przewodzących łodygi ziemniaka lub pomidora; umieszcza się je w małej objętości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego i pozostawia się na 5-10 minut;

2) wykonuje się serie dziesięciokrotnych rozcieńczeń zawiesiny (1:10 i 1:100 lub więcej, jeśli uzna się za stosowne);

3) przenosi się standardową objętość zawiesiny i jej rozcieńczeń na podstawowe podłoża odżywcze NA, YPGA i SPA, o których mowa w części IV ust. 1, lub na podłoże Kelmana z chlorkiem tetrazoliowym, o którym mowa w części IV ust. 1, lub na podłoże selektywne SMSA, o którym mowa w części IV ust. 7; wykonuje się posiew za pomocą ezy lub głaszczki, stosując odpowiednią technikę rozcieńczeń płytkowych; jeżeli uzna się za stosowne, wykonuje się kontrolę pozytywną drogą posiewu rozcieńczonej zawiesiny patogenicznej kultury bakterii Ralstonia solanacearum, należącej do biowaru 2/rasy 3 bakterii Ralstonia solanacearum na oddzielnych płytkach z każdym z podłoży;

4) płytki inkubuje się przez 3 dni w temperaturze 28 °C; jeżeli wzrost jest powolny, czas inkubacji można wydłużyć do 6 dni, mając na uwadze, że na podłożu SMSA kolonie bakterii często stają się nietypowe i zamierają:

a) na podstawowych podłożach odżywczych patogeniczne izolaty bakterii Ralstonia solanacearum tworzą perłowobiałe, płaskie, nieregularne i fluidalne kolonie, często z charakterystycznymi zagłębieniami,

b) na podłożu Kelmana z chlorkiem tetrazoliowym typowe kolonie patogenicznych izolatów bakterii Ralstonia solanacearum są kremowe, płaskie, nieregularne i fluidalne z krwistoczerwonym, zagłębionym środkiem; niepatogeniczne formy tej bakterii produkują ciemnoczerwone kolonie o masłowatej konsystencji,

c) na podłożu SMSA typowe kolonie patogenicznych izolatów bakterii Ralstonia solanacearum są mlecznobiałe, płaskie, nieregularne i fluidalne, z krwistoczerwonym środkiem; niepatogeniczne formy tej bakterii produkują mniej fluidalne kolonie, całkowicie różowe do czerwonych;

5) kolonie o charakterystycznej morfologii przeszczepia się na podstawowe podłoże odżywcze w celu uzyskania czystej kultury; należy unikać regularnego przeszczepiania, które może prowadzić do utraty patogeniczności.

4. Testy potwierdzające

1) Czystą kulturę bakterii Ralstonia solanacearum identyfikuje się, stosując co najmniej jeden z następujących testów:

a) testy biochemiczne i fizjologiczne przeprowadzane w celu określenia, czy wyizolowane bakterie posiadają właściwości biochemiczne i fizjologiczne, typowe dla bakterii Ralstonia solanacearum; do każdego testu dołącza się odpowiedni szczep kontrolny

barwnik fluoryzujący	-
inkluzje PHB	+
test oksydacyjno-fermentacyjny (O/F)	O+/F-
katalaza	+
test Kovacsa	+
redukcja azotanów	+
wykorzystanie cytrynianu	+
wzrost w temperaturze 40 °C	-
wzrost w 1 % NaCl	+
wzrost w 2 % NaCl	-
dihydrolaza argininy	-
hydroliza żelatyny	-
hydroliza skrobi	-
hydroliza eskuliny	-
produkcja lewanu	-

b) test IF - przygotowuje się zawiesinę 10⁶ komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego oraz wykonuje się serię dwukrotnych rozcieńczeń przeciwciał; test IF przeprowadza się zgodnie ze sposobem, o którym mowa w części III ust. 2; miano dla badanej kultury musi być równoważne mianu dla kontroli pozytywnej,

c) test ELISA - przygotowuje się zawiesinę >10⁶ komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego; test ELISA przeprowadza się zgodnie ze sposobem, o którym mowa w części III ust. 3; odczyty w teście ELISA dla badanej kultury muszą być równoważne wartościom uzyskanym dla kontroli pozytywnej,

d) test PCR - przygotowuje się zawiesinę 10⁶ komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego; test PCR przeprowadza się zgodnie ze sposobem, o którym mowa w części III ust. 4; uzyskany produkt PCR dla badanej kultury musi mieć taką samą wielkość i wzór uzyskany w analizie z użyciem enzymów restrykcyjnych (REA) jak kontrola pozytywna,

e) fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ (FISH) - przygotowuje się zawiesinę 10⁶ komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego; stosuje się metodę FISH z primerem PCR OLI-1; badana kultura musi wykazywać taką samą reakcję jak kontrola pozytywna,

f) profil białkowy - zdenaturowane białka komórkowe są rozdzielane drogą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym - PAGE,

g) analiza kwasów tłuszczowych (FAP) - hoduje się badaną kulturę i szczep bakterii kontroli pozytywnej przez 48 godzin, w temperaturze 28 °C, na agarze sojowo-tryptonowym oraz stosuje metodę FAP; profil badanej kultury musi być identyczny z profilem kontroli pozytywnej; charakterystyka kwasów tłuszczowych jest następująca: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH i 18:1 2OH;

2) oznaczanie szczepu jest zalecane w każdym nowym przypadku wykrycia bakterii Ralstonia solanacearum; stosuje się co najmniej jedną z następujących metod:

a) określanie biowaru na podstawie zdolności do produkcji kwasu z trzech alkoholi sześciowęglowych i trzech cukrów

wykorzystywanie	Biowar
	1	2	3	4	5
- maltozy	-	+	+	-	+
- laktozy	-	+	+	-	+
- celobiozy	-	+	+	-	+
- mannitolu	-	-	+	+	+
- sorbitolu	-	-	+	+	-
- dulcitolu	-	-	+	+	-

dodatkowe testy na rozróżnienie w obrębie biowaru 2 podfenotypów

	biowar 2	biowar 2-A	biowar 2-T
wykorzystywanie trehalozy	-	+	+
wykorzystywanie inozytolu	+	-	+
wykorzystywanie D-rybozy	-	-	+
aktywność pektolityczna	niska	niska	wysoka

b) określanie rasy na podstawie testu patogeniczności na roślinach pomidora lub oberżyny i roślinach tytoniu oraz na podstawie reakcji nadwrażliwości (HR) na liściach tytoniu

Reakcja	Rasa*)
	1	2	3
na roślinach pomidora/oberżyny	więdnięcie	brak reakcji	więdnięcie
na roślinach tytoniu	więdnięcie	brak reakcji	brak reakcji
na liściach tytoniu	nekroza (48 h) i więdnięcie (7-8 dni)	HR (12-24 h)	chloroza (2-8 dni)

^*) Nie uwzględniono rasy 4 (patogeniczna dla imbiru i niektórych innych roślin żywicielskich) i rasy 5 (patogeniczna wyłącznie dla morwy).

Określenie rasy na podstawie testu patogeniczności lub testu nadwrażliwości na roślinach tytoniu może być niewystarczająco wiarygodne; o rasie można wnioskować na podstawie biowaru i naturalnej rośliny żywicielskiej.

Szczepy bakterii Ralstonia solanacearum można rozróżnić na poziomie molekularnym za pomocą:

- analizy RFLP,

- powtarzalnej sekwencji PCR (REP-, ERIC- i BOX-PCR);

3) test patogeniczności stosuje się w celu potwierdzenia diagnozy oraz w celu określania patogeniczności kultur zidentyfikowanych jako bakteria Ralstonia solanacearum, wykonując następujące czynności:

a) przygotowuje się inokulum 10⁶ komórek/ml badanej kultury i szczepu kontroli pozytywnej,

b) inokuluje się 5-10 roślin pomidora lub oberżyny, najlepiej w stadium trzeciego liścia właściwego lub starszych, zgodnie z metodą określoną w części III ust. 6,

c) rośliny inkubuje się do dwóch tygodni w temperaturze 22-28 °C i względnie wysokiej wilgotności, codziennie podlewając,

d) prowadzi się obserwacje w celu stwierdzenia, czy na roślinach występują objawy więdnięcia, epinastii, chlorozy i karłowatości,

e) bakterie izoluje się z roślin z objawami choroby w następujący sposób:

- wycina się fragment tkanki łodygi dwa centymetry powyżej miejsca inokulacji,

- tkankę łodygi rozdrabnia się i zawiesza w niewielkiej objętości sterylnej wody destylowanej lub w 50 mM buforu fosforanowego, a następnie posiewa się na podłoże, inkubuje i sprawdza występowanie typowych kolonii bakterii Ralstonia solanacearum.

III.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka

1. Przygotowanie próby do badania

Standardowa próba składa się z co najmniej 200 bulw pobranych z partii bulw ziemniaka o masie 25 ton, jednakże badanie można również wykonać dla mniejszych prób.

W celu stymulacji namnażania małych populacji bakterii Ralstonia solanacearum można, jeżeli uzna się to za stosowane, inkubować próbę w temperaturze 25-30 °C do dwóch tygodni.

Przed przystąpieniem do właściwego badania, bulwy można umyć pod bieżącą wodą z użyciem odpowiednich dezynfektantów i detergentów, a następnie osuszyć na powietrzu.

Sposób postępowania przy przygotowaniu ekstraktu:

1) za pomocą czystego i zdezynfekowanego skalpela lub noża do obierania warzyw usuwa się skórkę z części przystolonowej bulwy w taki sposób, aby uwidocznić wiązki przewodzące; ostrożnie wycina się z części przystolonowej tkankę przewodzącą w postaci małego stożka o średnicy 3-5 mm; ilość tkanki innej niż przewodząca należy ograniczyć do minimum; w ten sam sposób postępuje się z każdą bulwą wchodzącą w skład próby; na tym etapie można dokonać wizualnej oceny bulw; bulwy z objawami choroby lub gnijące poddaje się odrębnym badaniom określonym w części II;

2) tkankę pobraną z części przystolonowej bulw umieszcza się w zamkniętym pojemniku; jeżeli nie jest możliwe bezpośrednie przeprowadzenie badania, materiał można przechować do 24 godzin, a w temperaturze 4 °C - nie dłużej niż 72 godziny;

3) tkankę pobraną z części przystolonowej:

a) przenosi się do odpowiedniego pojemnika, a następnie dodaje się odpowiednią objętość buforu do maceracji, o którym mowa w części IV ust. 2, w taki sposób, aby pokryć tkankę; rozdrabnia się w homogenizatorze, nie dopuszczając do nadmiernej homogenizacji; macerat pozostawia się na 15-30 minut lub

b) przenosi się do odpowiedniego pojemnika, a następnie dodaje się odpowiednią objętość buforu do maceracji w taki sposób, aby pokryć tkankę; pojemnik z tkanką wytrząsa się na wstrząsarce obrotowej przy 50-100 obrotów/min przez 4 godziny w temperaturze 20-22 °C lub przez 16-24 godzin w temperaturze 4 °C, lub

c) przenosi się do mocnej jednorazowej torebki do maceracji, a następnie miażdży się aż do uzyskania homogenatu; dodaje się odpowiednią objętość buforu do maceracji w taki sposób, aby pokryć tkankę; macerat pozostawia się na 15-30 minut;

4) bakterie ekstrahuje się ze zmacerowanej tkanki pobranej z części przystolonowej w następujący sposób:

a) macerat delikatnie dekantuje się do probówki wirówkowej, pozostawiając jego resztki w pojemniku lub torebce; jeżeli zdekantowany macerat jest mętny, odwirowuje się go z zastosowaniem następujących parametrów: 180 g/10 minut/<10 °C; zdekantowany macerat lub supernatant uzyskany podczas wirowania wstępnego odwirowuje się z zastosowaniem następujących parametrów: 7.000 g/15 minut/<10 °C lub 10.000 g/10 minut/<10 °C; supernatant zlewa się bez naruszania osadu lub

b) macerat przefiltrowuje się z użyciem filtra o wielkości oczek 40-100 µm; filtrowanie można ułatwić, stosując pompę próżniową; filtrat zbiera się do probówki wirówkowej, a filtr przepłukuje się buforem do maceracji; filtrat odwirowuje się z zastosowaniem następujących parametrów: 7.000 g/15 minut/<10 °C lub 10.000 g/10 minut/<10 °C; supernatant zlewa się bez naruszania osadu;

5) osad zawiesza się w 1 ml buforu do zawieszania osadu, o którym mowa w części IV ust. 2, a następnie dzieli na dwie równe porcje i przenosi do mikroprobówek; ekstrakt z jednej mikroprobówki wykorzystuje się do badań, a jego pozostałość przechowuje się na czas badania w temperaturze 4 °C; do drugiej probówki dodaje się kroplę sterylnego glicerolu i miesza się na wstrząsarce typu worteks, a następnie przechowuje się w temperaturze -18 °C przez kilka tygodni lub w temperaturze -70 °C przez kilka miesięcy.

2. Test IF

W teście IF używa się przeciwciał na bakterię Ralstonia solanacearum (najlepiej rasa 3/biowar 2). Miano przeciwciał określa się z użyciem zawiesiny 10⁶ komórek/ml homologicznego szczepu bakterii Ralstonia solanacearum i koniugatu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w odpowiednim rozcieńczeniu, zgodnie z instrukcją stosowania. Przeciwciała wyjściowe powinny posiadać miano co najmniej 1:2.000.

W teście używa się szkiełek mikroskopowych wielopunktowych; zalecane są szkiełka 10. punktowe o średnicy 6 mm. Na każdym szkiełku mikroskopowym umieszcza się kontrolę negatywną, w celu sprawdzenia, czy koniugat (FITC) nie wiąże się niespecyficznie z antygenem bakteryjnym. Badanie powtarza się, jeśli w okienku z kontrolą negatywną obecne są fluoryzujące komórki bakterii.

Preparaty z kontrolą pozytywną wykonuje się oddzielne, z użyciem zawiesiny 10⁶ komórek/ml szczepu należącego do odpowiedniej rasy/biowaru bakterii Ralstonia solanacearum. Dla każdego zestawu testów wykonuje się jeden preparat kontrolny.

Sposób wykonania badania:

1) preparaty z badanych prób wykonuje się w następujący sposób:

a) w przypadku osadu z niewielką zawartością skrobi - za pomocą pipety nanosi się na okienka, w jednym rzędzie, standardową objętość zawieszonego w buforze osadu; standardową objętością dla okienek o średnicy 6 mm jest 15 µl; dla okienek o większej średnicy należy dokonać proporcjonalnych przeliczeń; drugi rząd okienek może być użyty jako powtórzenie próby lub dla kolejnej próby, zgodnie ze schematem 1,

b) w przypadku pozostałych ekstraktów - wykonuje się dziesięciokrotne rozcieńczenia ekstraktu (1:10, 1:100 i 1:1.000) w buforze do zawieszania osadu; za pomocą pipety nanosi się na okienka, w jednym rzędzie, standardową objętość zawieszonego w buforze osadu i jego rozcieńczenia; standardową objętością dla okienek o średnicy 6 mm jest 15 µl; dla okienek o większej średnicy należy dokonać proporcjonalnych przeliczeń; drugi rząd okienek może być użyty jako powtórzenie próby lub dla kolejnej próby, zgodnie ze schematem 2;

Schemat 1

Standardowe rozcieńczenie zawieszonego w buforze osadu

schemat

Schemat 2

Standardowe rozcieńczenia przeciwciał

schemat

2) krople pozostawia się do wyschnięcia, a następnie preparat utrwala się przez ogrzanie, opalenie lub z użyciem 95 % etanolu;

3) w przypadku gdy preparaty wykonuje się zgodnie ze sposobem określonym w pkt 1 lit. a, sporządza się zestaw dwukrotnych rozcieńczeń [1/4 miana (M/4), 1/2 miana (M/2), miano (M) i podwojone miano (2M)] przeciwciał w buforze IF, o którym mowa w części IV ust. 3; w przypadku sposobu określonego w pkt 1 lit. b - sporządza się rozcieńczenie robocze (RR) przeciwciał w buforze IF; rozcieńczenie robocze jest rozcieńczeniem przeciwciał o optymalnej specyficzności i stanowi ono zwykle połowę miana:

a) preparaty umieszcza się na wilgotnej bibule; okienka z badanymi próbami pokrywa się przeciwciałami, a w okienku z kontrolą negatywną FITC umieszcza się bufor PBS; naniesiona na okienka objętość przeciwciał musi być równoważna objętości naniesionego ekstraktu,

b) preparaty inkubuje się pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia,

c) krople przeciwciał usuwa się z preparatów, a następnie preparaty ostrożnie spłukuje się buforem IF; moczy się przez pięć minut w buforze IF-Tween, a następnie pięć minut w buforze IF i ostrożnie usuwa się nadmiar wilgoci,

d) preparaty umieszcza się na wilgotnej bibule; okienka z badanymi próbami oraz okienko z kontrolą negatywną FITC pokrywa się koniugatem FITC w rozcieńczeniu użytym przy określaniu miana; naniesiona na okienka objętość koniugatu (FITC) musi być identyczna jak objętość naniesionych przeciwciał,

e) preparaty inkubuje się pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia,

f) krople koniugatu usuwa się z preparatu, preparat płucze się, a następnie moczy w sposób określony w lit. c i ostrożnie usuwa się nadmiar wilgoci,

g) na każde okienko nanosi się za pomocą pipety 5-10 µl 0,1 M buforu fosforanowego z glicerolem, o którym mowa w części IV ust. 3, lub podobnego utrwalacza i nakłada się szkiełko nakrywkowe;

4) odczyt testu IF - preparaty ogląda się w mikroskopie epifluorescencyjnym z filtrami odpowiednimi dla wzbudzenia FITC pod imersją, stosując powiększenie 500-1.000x; okienka przegląda się w poprzek dwóch średnic przeciętych pod kątem prostym oraz wokół obwodu okienka; najpierw sprawdza się preparat z kontrolą pozytywną; komórki muszą być wyraźnie zabarwione i wykazywać jasną fluorescencję; test należy powtórzyć, jeśli zabarwienie jest niewłaściwe; przeglądając preparaty z badaną próbą, najpierw sprawdza się, czy w kontroli FITC nie występują fluoryzujące komórki; obecność fluoryzujących komórek w kontroli FITC wskazuje na niespecyficzne wiązanie koniugatu FITC, autofluorescencję lub kontaminację; test należy powtórzyć, jeżeli takie zjawisko występuje; okienka z badanymi próbami przegląda się, poszukując jasno fluoryzujących komórek o charakterystycznej dla bakterii Ralstonia solanacearum morfologii; intensywność fluorescencji musi być równoważna z intensywnością fluorescencji w preparacie z kontrolą pozytywną z użyciem tego samego rozcieńczenia przeciwciał; komórki niecałkowicie zabarwione lub słabo fluoryzujące muszą być pominięte, chyba że występuje wiele takich komórek.

Interpretacja wyników testu IF:

1) jeżeli nie stwierdzono obecności jasno fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, wynik testu jest negatywny;

2) jeżeli stwierdzono obecność jasno fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, określa się średnią ilość komórek w polu widzenia i oblicza się ilość komórek (N) w ml zawieszonego osadu według wzoru określonego w części IV ust. 4; populacja stanowiąca około 10³ komórek/ml zawieszonego osadu jest uznawana za granicę wykrywalności w teście IF, a więc w przypadku prób o:

a) N > 10³ komórek/ml zawieszonego osadu - wynik testu jest uznawany za pozytywny,

b) N < 10³ komórek/ml zawieszonego osadu - wynik testu może być uznawany za pozytywny;

3) jeżeli w zakresie miana przeciwciał widoczna jest duża ilość (> 10⁵ komórek/ml) częściowo lub słabo fluoryzujących komórek, wykonuje się drugi test:

a) oparty na innej zasadzie biologicznej lub

b) powtórny test IF z użyciem innych przeciwciał albo z użyciem dziesięciokrotnie rozcieńczonego osadu.

3. Test ELISA

W teście ELISA używa się przeciwciał na bakterię Ralstonia solanacearum (najlepiej rasę 3/biowar 2). Miano określa się z użyciem zawiesiny 10⁶ komórek/ml homologicznego szczepu bakterii Ralstonia solanacearum. Używa się płytek titracyjnych. Sporządza się kontrolę negatywną z użyciem ekstraktu ze zdrowych ziemniaków i kontrolę buforu fosforanowego (PBS); jako kontroli pozytywnej używa się zawiesiny o stężeniu >10⁶ komórek/ml szczepu należącego do odpowiedniej rasy/biowaru bakterii Ralstonia solanacearum. Z kontrolą pozytywną postępuje się w taki sam sposób jak z badanymi próbami, przy czym kontrolę pozytywną wyraźnie oddziela się od badanej próby na płytce titracyjnej.

Sposób wykonania badania:

1) wprowadza się 100-200 µl zawieszonego osadu za pomocą pipety do mikroprobówki, którą podgrzewa się przez 4 minuty w temperaturze 100 °C, a następnie pozostawia w lodzie;

2) dodaje się równoważną objętość podwójnie stężonego buforu opłaszczającego, o którym mowa w części IV ust. 5, oraz miesza się na wstrząsarce typu worteks;

3) nanosi się po 100 µl ekstraktu do co najmniej dwóch studzienek w płytce titracyjnej, a następnie inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C lub pozostawia do następnego dnia w temperaturze 4 °C;

4) ekstrakt usuwa się ze studzienek, a studzienki wypłukuje się trzykrotnie buforem PBS-Tween, o którym mowa w części IV ust. 5, pozostawiając bufor w studzienkach przy ostatnim płukaniu na co najmniej 5 minut;

5) sporządza się odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał na bakterię Ralstonia solanacearum w buforze blokującym, o którym mowa w części IV ust. 5; do studzienek nanosi się po 100 µl rozcieńczonych przeciwciał oraz inkubuje przez godzinę w temperaturze 37 °C;

6) przeciwciała usuwa się ze studzienek, a studzienki wypłukuje się w sposób określony w pkt 4;

7) sporządza się odpowiednie rozcieńczenie koniugatu z alkaliczną fosfatazą w buforze blokującym i nanosi się po 100 µl rozcieńczonego koniugatu do studzienek; płytki inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C;

8) koniugat, o którym mowa w pkt 7, usuwa się ze studzienek, a studzienki wypłukuje się w sposób określony w pkt 4;

9) sporządza się roztwór substratu alkalicznej fosfatazy, o którym mowa w części IV ust. 5, nanosi się po 100 µl do studzienek oraz inkubuje przez 30 minut do jednej godziny w ciemności, w temperaturze otoczenia;

10) absorbancję odczytuje się przy długości fali 409 nm.

Interpretacja wyników testu ELISA:

1) jeżeli gęstość optyczna (GO) próby jest <2 x GO kontroli negatywnej - wynik testu ELISA jest negatywny;

2) jeżeli gęstość optyczna (GO) próby jest >2 x GO kontroli negatywnej - wynik testu ELISA jest pozytywny.

4. Test PCR

Na wszystkich etapach przygotowania próby i podczas innych czynności związanych z przeprowadzaniem testu PCR używa się końcówek do pipet z filtrem. Sporządza się zawiesinę 10⁶ komórek/ml szczepu należącego do rasy 3/biowaru bakterii Ralstonia solanacearum jako kontrolę pozytywną. Z kontrolą pozytywną postępuje się w taki sam sposób jak z badanymi próbami.

Sposób wykonania badania:

1) wprowadza się 100 µl zawieszonego osadu za pomocą pipety do mikroprobówki albo przenosi się 90 µl zawieszonego osadu do mikroprobówki zawierającej 10 µl 0,5M NaOH; miesza się przez kilkakrotne odwrócenie probówki;

2) probówkę ogrzewa się przez 4 minuty w temperaturze 100 °C, a następnie pozostawia w lodzie;

3) sporządza się co najmniej dwa dziesięciokrotne rozcieńczenia (1:10 i 1:100) lub więcej, jeżeli uzna się za stosowne, w sterylnej wodzie destylowanej lub w wodzie ultraczystej (UPW);

4) przygotowuje się mieszaninę reakcyjną do testu PCR, o której mowa w części IV ust. 6, w sterylnej mikroprobówce i dodaje się składniki w następującej kolejności:

a) dla objętości 50 µl:

składnik	ilość	stężenie końcowe
woda sterylna destylowana lub UPW	30,8 µl-33,8 µl
10 x bufor PCR	5,0 µl	1 x
d-ATP	1,0 µl	0,2 mM
d-CTP	1,0 µl	0,2 mM
d-GTP	1,0 µl	0,2 mM
d-TTP	1,0 µl	0,2 mM
primer OLI-1 (20 µM)	2,5 µl	1 mM
primer Y-2 (20 µM)	2,5 µl	1 mM
Tag polimeraza (5 U/µl)	0,2 µl	1,0 U
	objętość całkowita 45 µl-48 µl

b) dla większej liczby reakcji - przelicza się ilość każdego składnika na wymaganą liczbę reakcji, a następnie miesza się składniki i przenosi 45 µl-48 µl mieszaniny do sterylnych probówek PCR; probówki z mieszaniną reakcyjną do PCR przetrzymuje się w lodzie,

c) dla objętości 25 µl - składniki przelicza się proporcjonalnie;

5) amplifikacja PCR:

a) probówki z zagotowaną próbą i kontrolą pozytywną można odwirować; do poszczególnych probówek z mieszaniną reakcyjną PCR dodaje się w następującej kolejności: 2-5 µl próby albo kontrolę negatywną (woda), albo kontrolę pozytywną; probówki umieszcza się w bloku grzejnym amplifikatora DNA,

b) przeprowadza się program, obejmujący następujące etapy:¹⁾

- jeden cykl: 2 minuty w temperaturze 96 °C (denaturacja),

- 50 cykli: 20 sekund w temperaturze 94 °C (denaturacja), 20 sekund w temperaturze 68 °C (przyłączanie primerów), 30 sekund w temperaturze 72 °C (wydłużanie kopii),

- jeden cykl: 10 minut w temperaturze 72 °C (dalsze wydłużanie),

- jeden cykl: utrzymywanie w temperaturze 4 °C,

c) probówki wyjmuje się z amplifikatora i analizuje produkt PCR; jeżeli analiza nie będzie wykonywana bezpośrednio, probówki przechowuje się w temperaturze 4 °C w celu użycia jeszcze tego samego dnia, lub w temperaturze -18 °C, jeżeli analiza będzie przeprowadzana w późniejszym terminie;

______

¹⁾ Podane parametry przewidziane są dla amplifikatora Perkin Elmer 9600; w przypadku innych amplifikatorów konieczne może być dodanie do probówki reakcyjnej PCR oleju mineralnego lub modyfikacja czasu w etapie obejmującym 50 cykli.

6) analiza produktu PCR drogą elektroforezy agarozowej i barwienia bromkiem etydyny:

a) sporządza się odpowiedni żel agarozowy, doprowadzając stopniowo do wrzenia agarozę w buforze do elektroforezy (TAE),

b) płynną agarozę schładza się do temperatury 50-60 °C, a następnie wlewa pomiędzy dwie płyty w celu uformowania żelu i montuje grzebień; pozostawia się do zestalenia,

c) usuwa się grzebień; żel zanurza się w buforze TAE w taki sposób, aby był pokryty 2-3 mm warstwą buforu,

d) na parafilmie umieszcza się 3 µl kroplę buforu obciążającego; dodaje się 12 µl produktu PCR z próby, z kontroli pozytywnej lub z kontroli negatywnej (woda), po czym miesza się kilkakrotnie nabierając i wypuszczając mieszaninę z końcówki pipety; podane objętości mogą być modyfikowane w taki sposób, aby odpowiadały rozmiarowi kieszonki w żelu agarozowym,

e) ostrożnie napełnia się kieszonki w żelu; w co najmniej jednej kieszonce umieszcza się odpowiedni wzorzec DNA jako odniesienie,

f) prowadzi się elektroforezę przy parametrach 5-8 V/cm do chwili, aż wskaźnik osiągnie poziom 1 cm od końcowego brzegu żelu,

g) po wyłączeniu aparatu do elektroforezy, ostrożnie wyjmuje się żel i zanurza się w roztworze bromku etydyny na 30-45 minut, używając rękawic jednorazowych,

h) żel odbarwia się w wodzie destylowanej przez 10-15 minut,

i) zamplifikowany fragment ogląda się w transiluminatorze UV; produkt PCR dla bakterii Ralstonia solanacearum z zestawem primerów OLI-1 i Y-2 ma wielkość 288 bp; porównuje się go z markerem DNA i kontrolą pozytywną; kontrola negatywna (woda) w każdym przypadku musi być negatywna, w przeciwnym przypadku test należy powtórzyć,

j) wykonuje się fotografię żelu w celu udokumentowania wyników, jeżeli jest to wymagane,

k) potwierdza się autentyczność zamplifikownego fragmentu drogą analizy z użyciem enzymów restrykcyjnych (REA);

7) analiza z użyciem enzymów restrykcyjnych (REA):

a) przenosi się 8,5 µl produktu PCR do nowej mikroprobówki i dodaje się 1 µl stężonego 10 x buforu do enzymu i 0,5 µl enzymu restrykcyjnego Ava II,

b) zawartość probówki miesza się kilkakrotnie nabierając i wypuszczając mieszaninę z końcówki pipety; jeżeli na ściankach mikroprobówki pozostaną krople, krótko wiruje się w mikrowirówce oraz inkubuje się przez godzinę w temperaturze 37 °C,

c) analizuje się strawiony przez enzymy restrykcyjne fragment PCR drogą elektroforezy agarozowej w sposób określony ust. 4 pkt 6.

Interpretacja wyników testu PCR:

1) jeżeli nie wykryto charakterystycznego fragmentu 288 bp, a fragment ten został wykryty w kontroli pozytywnej Ralstonia solanacearum - wynik testu PCR jest negatywny;

2) jeżeli wykryto charakterystyczny fragment 288 bp, a analiza REA zamplifikowanego fragmentu jest identyczna jak w przypadku kontroli pozytywnej bakterii Ralstonia solanacearum - wynik testu PCR jest pozytywny.

5. Izolacja na podłoża selektywne

1) izolację przeprowadza się z zastosowaniem techniki rozcieńczeń płytkowych, np.:

a) sporządza się co najmniej dwa 10. rozcieńczenia osadu zawieszonego w buforze do osadu (1:10 i 1:100) lub więcej, jeśli uzna się za stosowne; nanosi się za pomocą pipety odmierzoną standardową objętość (50-100 µl) zawieszonego w buforze osadu i każde jego rozcieńczenie na zmodyfikowane podłoże selektywne SMSA, o którym mowa w części IV ust. 7, po czym rozprowadza się na powierzchni podłoża za pomocą szklanej głaszczki; jeżeli uzna się za stosowne, wykonuje się posiew zawieszonego osadu za pomocą ezy z oczkiem o objętości 10 µl; po każdym etapie ezę opala się lub

b) przenosi się odmierzoną standardową objętość (50-100 µl) zawieszonego w buforze osadu na zmodyfikowane podłoże selektywne SMSA i rozprowadza na całej powierzchni podłoża za pomocą szklanej głaszczki; wykonuje się posiew bez opalania głaszczki, na co najmniej dwóch innych szalkach ze zmodyfikowanym podłożem SMSA;

2) przygotowuje się kontrolę pozytywną, stosując tę samą metodę rozcieńczeń płytkowych w odniesieniu do zawiesiny 10⁶ komórek/ml patogenicznej rasy 3/biowaru 2 bakterii Ralstonia solanacearum na oddzielnym zestawie płytek ze zmodyfikowanym podłożem SMSA;

3) płytki inkubuje się w temperaturze 28 °C, a odczyt wyniku rozpoczyna się po trzech dniach; w przypadku wyniku negatywnego płytkę inkubuje się dalej, do sześciu dni; kolonie patogenicznych izolatów bakterii Ralstonia solanacearum są mlecznobiałe, płaskie, nieregularne i fluidalne, z krwistoczerwonym zagłębionym środkiem, wykazujące wewnętrzne bruzdki;

4) kolonie bakterii o charakterystycznej morfologii, w celu uzyskania czystej kultury, przeszczepienia się na podstawowe podłoże odżywcze, o którym mowa w części IV ust. 1;

5) identyfikuje się czystą kulturę w sposób określony w części II ust. 4 pkt 1 i potwierdza identyfikację bakterii Ralstonia solanacearum na podstawie testu patogeniczności, o którym mowa w części II ust. 4 pkt 3.

Interpretacja wyników uzyskanych w metodzie izolacji na podłoża selektywne:

1) jeżeli w ciągu sześciu dni nie wyrosną żadne kolonie lub nie zostaną wyizolowane kolonie charakterystyczne dla bakterii Ralstonia solanacearum, pod warunkiem że nie podejrzewa się hamującego wpływu innych kolonii bakterii, oraz jeżeli w kontroli pozytywnej obecne są kolonie charakterystyczne dla bakterii Ralstonia solanacearum - wynik izolacji na podłoża selektywne uznaje się za negatywny;

2) jeżeli obecne są kolonie charakterystyczne dla bakterii Ralstonia solanacearum - wynik izolacji na podłoża selektywne uznaje się za pozytywny.

6. Test biologiczny

1) dla każdej badanej próby używa się 10 sadzonek roślin testowych podatnej odmiany pomidora lub oberżyny w stadium trzeciego liścia właściwego; nie podlewa się roślin 24 godziny przed inokulacją;

2) 100. µl zawieszonego osadu inokuluje się rośliny testowe, wkłuwając igłę w łodygę pomiędzy liścieniami oraz w jedno lub kilka innych miejsc;

3) przygotowuje się kontrolę pozytywną; stosując tę samą technikę inokuluje się 10 sadzonek zawiesiną 10⁶ komórek/ml patogenicznego szczepu bakterii Ralstonia solanacearum biowar 2/rasa 3 jako kontrolę pozytywną oraz kontrolę negatywną, inokulując rośliny buforem do zawieszenia osadu; rośliny stanowiące kontrolę pozytywną oddziela się od pozostałych roślin w celu uniknięcia kontaminacji;

4) rośliny testowe hoduje się dalej, do czterech tygodni, w temperaturze 22-28 °C i w warunkach wysokiej wilgotności względnej, codziennie podlewając; prowadzi się obserwacje w celu stwierdzenia, czy na roślinach wystąpią objawy więdnięcia, epinastii, chlorozy lub karłowatości;

5) izoluje się bakterie z zainokulowanych roślin i dokonuje się identyfikacji czystej kultury o charakterystycznej morfologii w sposób określony w części II ust. 4 pkt 1 oraz potwierdza się identyfikację kultury jako bakterię Ralstonia solanacearum na podstawie testu patogeniczności, o którym mowa w części II ust. 4 pkt 3;

6) w przypadku zestawu roślin z badanej próby niewykazujących objawów choroby, jeżeli uzna się za stosowne, sprawdza się, czy nie występuje infekcja latentna: z każdej rośliny testowej wycina się 1. cm fragment łodygi w odległości 2 cm od miejsca inokulacji; pobraną tkankę homogenizuje się w buforze do maceracji, a następnie wykonuje się posiew metodą rozcieńczeń, o której mowa w części III ust. 5 pkt 1; jeżeli wynik jest pozytywny, dokonuje się identyfikacji czystych kultur o charakterystycznej morfologii w sposób określony w części II ust. 4 pkt 1 oraz potwierdza się identyfikację kultury jako bakteria Ralstonia solanacearum na podstawie testu patogeniczności, o którym mowa w części II ust. 4 pkt 3.

Interpretacja wyniku testu biologicznego:

1) jeżeli rośliny testowe nie są porażone przez bakterię Ralstonia solanacearum, a bakteria Ralstonia solanacearum została wykryta w kontroli pozytywnej - wynik testu biologicznego uznaje się za negatywny;

2) jeżeli rośliny testowe są porażone przez bakterię Ralstonia solanacearum - wynik testu biologicznego uznaje się za pozytywny.

7. Testy wzbogacania

1) przenosi się 100 µl zawieszonego osadu do 3 ml zmodyfikowanego bulionu SMSA, o którym mowa w części IV ust. 7;

2) mieszaninę inkubuje się 48 godzin, ale nie dłużej niż 72 godziny, w temperaturze 28 °C, z luźno umocowanym korkiem probówki w celu zapewnienia dostępu powietrza;

3) wciska się korek i miesza się na wstrząsarce typu worteks; rozdziela się go do celów testu IF, testu ELISA lub testu PCR.

8. Test patogeniczności

Test patogeniczności przeprowadza się w sposób określony w części II ust. 4 pkt 3.

IV.

Odczynniki, podłoża i testy stosowane przy diagnozowaniu, wykrywaniu i identyfikacji bakterii Ralstonia solanacearum

1. Podłoża do izolacji i hodowli Ralstonia solanacearum

1) Nutrient Agar (NA) - agar odżywczy

Nutrient Agar (Difco) 23 g

Woda destylowana 1 litr

przygotowuje się półlitrowe porcje pożywki w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza się składniki i sterylizuje w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; schładza się do temperatury 50 °C, a następnie rozlewa na płytki;

2) Yeast-Peptone-Glucose-Agar (YPGA) - agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy

Yeast Extract (Difco) 5 g

Bacto Peptone (Difco) 5 g

D(+) glukoza (jednowodna) 10 g

Bacto Agar (Difco) 15 g

Woda destylowana 1 litr

przygotowuje się półlitrowe porcje pożywki w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza się składniki i sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; schładza się do temperatury 50 °C, a następnie rozlewa się na płytki;

3) Sucrose Peptone Agar (SPA) - agar z sacharozą i peptonem

Sacharoza 20 g

Pepton 5 g

K₂HPO₄ 0,5 g

MgSO₄ x 7 H₂O 0,25 g

Bacto Agar (Difco) 15 g

Woda destylowana 1 litr

przygotowuje się półlitrowe porcje pożywki w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza się składniki; ustala się pH 7,2-7,4, jeżeli jest to konieczne; sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; schładza się do temperatury 50 °C, a następnie rozlewa się na płytki;

4) Podłoże Kelmana z chlorkiem tetrazoliowym

Casamino acids (Difco) 1 g

Bacto Peptone (Difco) 10 g

Glukoza 5 g

Bacto Agar (Difco) 15 g

Woda destylowana 1 litr

przygotowuje się półlitrowe porcje pożywki w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza się składniki; sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; schładza się do temperatury 50 °C; dodaje się wodny roztwór triphenylu tetrazolium chloride (Sigma) sterylizowany drogą filtrowania tak, aby uzyskać ostateczne stężenie 50 mg na litr; rozlewa się na płytki.

2. Materiały do przygotowania próby

1) bufor do maceracji: 50 mM bufor fosforanowy, pH 7,0

Na₂HPO₄ 4,26 g

KH₂PO₄ 2,72 g

Woda destylowana 1 litr

bufor ten jest stosowany do maceracji tkanek; rozpuszcza się składniki i ustala się pH; dzieli się na mniejsze porcje, jeżeli uzna się za stosowne; sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; w przypadku wykonywania testu PCR zaleca się dodanie 5 % polyvinylpyrrolidone-40000 MWT (PVP-40) w celu zmniejszenia inhibicji amplifikacji przez cząsteczki związków aromatycznych obecnych w ekstrakcie; w przypadku przeprowadzenia homogenizowania tkanek ziemniaka zaleca się dodanie środka zapobiegającego powstawaniu kłaczkowatości, środka przeciwpieniącego lub środka antyoksydacyjnego, w ilościach niezbędnych do uzyskania wymaganego stężenia;

Lubrol w płatkach 0,5 g /litr

DC Silicone antifoam 1,0 ml/litr

tetrasodium pyrophosphate 1,0 g/litr.

autoklawuje się oddzielnie; dodaje się do uzyskania wymaganego stężenia;

2) bufor do zawieszania osadu: 10 mM bufor fosforanowy, pH 7,2

Na₂HPO₄ x 12 H₂O 2,7 g

NaH₂PO₄ x 2 H₂O 0,4 g

Woda destylowana 1 litr

bufor ten jest stosowany do zawieszania tkanki przystolonowej bulwy i osadu; rozpuszcza się składniki i ustala pH; dzieli na mniejsze porcje, jeżeli uzna się za stosowne; sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.

3. Materiały do testu IF

1) bufor IF: 10 mM bufor fosforanowy (PBS), pH 7,2

Na₂HPO₄ x 12 H₂O 2,7 g

NaH₂PO₄ x 2 H₂O 0,4 g

NaCl 8,0 g

Woda destylowana 1 litr

bufor ten jest stosowany do sporządzania rozcieńczeń przeciwciał; rozpuszcza się składniki i ustala pH; dzieli się na mniejsze porcje, jeżeli uzna się za stosowne; sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut;

2) bufor IF - Tween

bufor ten jest stosowany do płukania preparatów; dodaje się 0,1 % Tween 20 do buforu IF;

3) 0,1 M bufor fosforanowy z glicerolem, pH 7,6

Na₂HPO₄ x 12 H₂O 3,2 g

NaH₂PO₄ x 2 H₂O 0,15 g

Glicerol 50 ml

Woda destylowana 100 ml

bufor ten jest stosowany w celu zapobiegania szybkiemu wygasaniu fluorescencji.

4. Określanie poziomu infekcji w teście IF

Powierzchnia (S) okienka na szkiełku wielopunktowym

πD²

S = ---- wzór (1)

4

gdzie:

D = średnica okienka.

Powierzchnia (s) pola widzenia obiektywu

πd²

s = ---- wzór (2)

4

gdzie:

d = średnica pola widzenia.

Określa się d na podstawie bezpośredniego pomiaru lub według następującego wzoru:

πi²

s = ----------- wzór (3)

G² x K² x 4

gdzie:

i = współczynnik pola (zależy od typu okularu i zawiera się w granicach od 8 do 24),

K = współczynnik tubusa (1 lub 1,25),

G = powiększenie 100x, 40x itp. obiektywu,

4s

d = Ö----

π

na podstawie wzoru (2)

wzór

na podstawie wzoru (3)

Liczy się typowe fluoryzujące komórki w polu widzenia (c).

Określa się liczbę typowych fluoryzujących komórek w okienku (C)

S

C = c-

s

Określa się liczbę typowych fluoryzujących komórek w ml osadu (N)

1.000

N = C x ------ x F

y

gdzie:

y = objętość osadu naniesionego na okienko,

F = współczynnik rozcieńczenia osadu.

5. Materiały do testu ELISA

1) podwójnie stężony opłaszczający bufor węglanowy, pH 9,6

Na₂CO₃ 6,36 g

NaHCO₃ 11,72 g

Woda destylowana 1 litr

rozpuszcza się składniki i ustala pH; dzieli się na mniejsze porcje, jeżeli uzna się za stosowne; sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; jeżeli ekstrakt zawiera wysokie frakcje cząsteczek związków aromatycznych, dodaje się siarczynu sodowego o stężeniu końcowym 0,2 % jako środka antyoksydacyjnego;

2) 10 x bufor fosforanowy (PBS), pH 7,4

NaCl 80 g

KH₂PO₄ 2 g

Na₂HPO₄ x 12 H₂O 29 g

KCl 2 g

Woda destylowana 1 litr

rozpuszcza się składniki i sprawdza pH; dzieli się na mniejsze porcje, jeżeli uzna się za stosowne; sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut;

3) bufor fosforanowy (PBS-T)

10 x PBS 100 ml

10 % Tween 20 5 ml

Woda destylowana 895 ml

Fiolet krystaliczny 5 mg/ litr

Polymixin B sulphate 100 mg/litr

Bacitracin^*) 25 mg/litr

Chloramphenicol 5 mg/litr

Penicilin-G 0,5 mg/litr

Tetrazolium salts 50 mg/litr

^*) zwiększenie stężenia Bacitracin do 300 ppm może zmniejszyć stopień kontaminacji przez bakterie saprofityczne bez redukcji wzrostu Ralstonia solanacearum;

składniki rozpuszcza się w 70 % etanolu, tak aby uzyskać dane stężenia dla objętości przygotowanego podłoża; niektóre składniki, mianowicie polymixin B i chloramphenicol wymagają lekkiego podgrzania i wstrząsania;

4) bufor blokujący (przeciwciała) (musi być świeżo przygotowany)

10 x PBS 10 ml

Polyvinylpyrrolidone-44000 MWT

(PVP-44) 2,0 g

10 % Tween 20 0,5 g

Mleko w proszku 0,5 g

Woda destylowana do 100 ml

5) roztwór substratu alkalicznej fosfatazy, pH 9,8

Diethanolamine 97 ml

Woda destylowana 800 ml

miesza się i ustala pH 9,8 za pomocą stężonego HCl; uzupełnia się do 1 litra wodą destylowaną; dodaje się 0,2 g MgCl₂; rozpuszcza się dwie 5 mg tabletki substratu fosfatazy (Sigma) w 15 ml roztworu.

6. Materiały do testu PCR

sekwencja oligonukleotydowa primera

Primer OLI-1 5'-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3'

Primer Y-2 5'-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'

7. Materiały do izolacji na podłoża selektywne i testów wzbogacania

1) podłoże selektywne SMSA

podłoże podstawowe:

Casamino acids (Difco) 1 g

Bacto Peptone (Difco) 10 g

Glicerol 5 ml

Agar (Difco) 15 g

Woda destylowana 1 litr

przygotowuje się półlitrowe porcje pożywki w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza się składniki i ustala pH; ustala się pH 6,5 przed autoklawowaniem, jeżeli jest to konieczne. Ralstonia solanacearum nie rośnie zbyt dobrze na podłożu o pH > 7,0; sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; schładza się do temperatury 50 °C; dodaje się następujące składniki (wszystkie z Sigmy), tak aby uzyskać podane ostateczne stężenie:

(średnio 600.000 jednostek) Sigma P-1004

(średnio 1.250 jednostek) Sigma B-0125

Sigma C-3175

(średnio 825 jednostek) Sigma P-3032

2) bulion SMSA

przygotowuje się w podobny sposób jak selektywne podłoże SMSA, lecz nie dodaje się agaru; rozdziela się po 3 ml do 30 ml uniwersalnych probówek.

• Identyfikator: Dz.U.2004.83.775
• Rodzaj: Rozporządzenie
• Tytuł: Szczegółowe sposoby postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania się bakterii Ralstonia solanacearum.
• Data aktu: 13/04/2004
• Data ogłoszenia: 27/04/2004
• Data wejścia w życie: 27/04/2004