Druga dyrektywa w sprawie zbliżenia ustawodawstw Państw Członkowskich odnoszących się do metod analizy niezbędnych do kontrolowania składu produktów kosmetycznych (82/434/EWG)

DRUGA DYREKTYWA KOMISJI

z dnia 14 maja 1982 r.

w sprawie zbliżenia ustawodawstw Państw Członkowskich odnoszących się do metod analizy niezbędnych do kontrolowania składu produktów kosmetycznych

(82/434/EWG)

(Dz.U.UE L z dnia 30 czerwca 1982 r.)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,

uwzględniając dyrektywę Rady 76/768/EWG z dnia 27 lipca 1976 r. w sprawie zbliżenia ustawodawstw Państw Członkowskich odnoszących się do produktów kosmetycznych⁽¹⁾, zmienioną dyrektywą 79/661/EWG⁽²⁾, w szczególności jej art. 8 ust. 1,

a także mając na uwadze, co następuje:

dyrektywa 76/768/EWG przewiduje urzędowe kontrolowanie produktów kosmetycznych w celu zapewnienia, aby spełnione zostały warunki ustanowione na mocy przepisów wspólnotowych dotyczących składu produktów kosmetycznych;

możliwie jak najszybciej należy opracować wszelkie niezbędne metody analizy; pierwszy etap na drodze do osiągnięcia tego celu został zrealizowany przez określenie niektórych metod w dyrektywie Komisji 80/1335/EWG⁽³⁾; drugi etap ma polegać na określeniu metod identyfikacji niektórych środków utleniających i oznaczania nadtlenku wodoru w kosmetykach do pielęgnacji włosów, identyfikacji i półilościowego oznaczania niektórych barwników utleniających w farbach do włosów, identyfikacji i oznaczania azotynów, identyfikacji i oznaczania wolnego formaldehydu, oznaczania rezorcyny w szamponach i płynach do włosów i oznaczania metanolu w stosunku do etanolu lub propanolu-2;

środki ustanowione w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Komitetu ds. Dostosowania do Postępu Technicznego Dyrektywy 76/768/EWG,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł  1

Państwa Członkowskie zobowiązane są podjąć wszelkie czynności, konieczne w celu zapewnienia, aby podczas urzędowego kontrolowania produktów kosmetycznych:

– identyfikację środków utleniających oraz oznaczanie nadtlenku wodoru w produktach kosmetycznych do pielęgnacji włosów,

– identyfikację i półilościowe oznaczanie niektórych barwników utleniających w farbach do włosów,

– identyfikację i oznaczanie azotynów,

– identyfikację i oznaczanie wolnego formaldehydu,

– oznaczanie rezorcyny w szamponach i płynach do włosów,

– oznaczanie metanolu w stosunku do etanolu lub propanolu- 2,

wykonywano zgodnie z metodami opisanymi w załącznikach.

Artykuł  2

Najpóźniej do dnia 31 grudnia 1983 r. Państwa Członkowskie zobowiązane są przyjąć przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy.

Państwa Członkowskie niezwłocznie powiadamiają o tym Komisję.

Artykuł  3

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 14 maja 1982 r.

	W imieniu Komisji
	Karl-Heinz NARJES
	Członek Komisji

______

⁽¹⁾ Dz.U. L 262 z 27.9.1976, str. 169.

⁽²⁾ Dz.U. L 192 z 31.7.1979, str. 35.

⁽³⁾ Dz.U. L 383 z 31.12.1980, str. 27.

ZAŁĄCZNIK ¹

..................................................

Notka Wydawnictwa Prawniczego "Lex"

Grafiki zostały zamieszczone wyłącznie w Internecie. Obejrzenie grafik podczas pracy z programem Lex wymaga dostępu do Internetu.

..................................................

I.

IDENTYFIKCJA ŚRODKÓW UTLENIAJĄCYCH I OZNACZANIE NADTLENKU WODORU W PRODUKTACH KOSMETYCZNYCH DO PIELĘGNACJI WŁOSÓW

CEL I ZAKRES

Jodometryczne oznaczanie nadtlenku wodoru w kosmetykach jest możliwe wyłącznie w przypadku nieobecności innych środków utleniających, które uwalniają jod z jodków. W związku z tym przed jodometrycznym oznaczeniem nadtlenku wodoru konieczne jest wykrycie i identyfikacja innych występujących środków utleniających. Identyfikacja ta dzieli się na dwa etapy: pierwszy obejmuje nadsiarczany, bromiany i nadtlenek wodoru, a drugi nadtlenek baru.

A.

IDENTYFIKCJA NADSIARCZANÓW, BROMIANÓW I NADTLENKU WODORU

1. ZASADA

Identyfikację nadsiarczanu sodu, nadsiarczanu potasu i nadsiarczanu amonu oraz bromianu potasu, bromianu sodu i nadtlenku wodoru - nawet tych pochodzących z nadtlenku baru - wykonuje się za pomocą chromatografii bibułowej zstępującej, z zastosowaniem dwóch rozpuszczalników rozwijających.

2. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki powinny być czystości analitycznej.

2.1. Wodne roztwory o odniesieniu 0,5% (m/v) następujących związków:

2.1.1. Nadsiarczan sodu

2.1.2. Nadsiarczan potasu

2.1.3. Nadsiarczan amonu

2.1.4. Bromian potasu

2.1.5. Bromian sodu

2.1.6. Nadtlenek wodoru

2.2. Rozpuszczalnik rozwijający A, etanol 80% (v/v)

2.3. Rozpuszczalnik rozwijający B, benzen - metanol - 3-metylobutan-l-ol - woda (34:38:18:10 obj)

2.4. Środek wywołujący A, 10-procentowy (m/v) roztwór wodny jodku potasu

2.5. Środek wywołujący B, 1-procentowy (m/v) roztwór wodny skrobi

2.6. Środek wywołujący C, 10-procentowy (m/m) kwas chlorowodorowy

2.7. 4 N kwas chlorowodorowy.

3. APARATURA I WYPOSAŻENIE

3.1. Bibuła chromatograficzna (bibuła "Whatman" nr 3 i nr 4 lub jej równoważniki)

3.2. Mikropipeta, 1 μl

3.3. Kolby miarowe, 100 ml

3.4. Sączki karbowane

3.5. Aparatura do zstępującej chromatografii bibułowej.

4. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI

4.1. Produkty rozpuszczalne w wodzie

Przygotować po dwa roztwory każdej próbki przez rozpuszczenie odpowiednio 1 g i 5 g produktu w 100 ml wody. Pobrać 1 μl każdego z tych roztworów do analizy metodą chromatografii bibułowej, opisaną w sekcji 5.

4.2. Produkty trudno rozpuszczalne w wodzie

4.2.1. Odważyć 1 g i 5 g próbki i zawiesić w 50 ml wody, uzupełnić do 100 ml wodą w obu przypadkach i wymieszać. Przesączyć obie dyspersje przez sączek karbowany (3.4) i pobrać po 1 μl każdego filtratu do analizy metodą chromatografii bibułowej, opisaną w sekcji 5.

4.2.2. Przygotować ponownie dwie dyspersje każdej próbki poprzez dyspergowanie 1g i 5 g w 50 ml wody, zakwaszając rozwodnionym kwasem solnym (2.7), mieszając i uzupełniając do 100 ml wodą. Przesączyć dyspersję przez sączek karbowany i pobrać 1 μl każdego filtratu do analizy metodą chromatografii bibułowej opisanej w sekcji 5.

4.3. Kremy

Zawiesić 5 g i 20 g każdego produktu w 100 ml wody i zastosować dyspersję do wykonania analizy metodą chromatografii bibułowej opisaną w sekcji 5.

5. METODA

5.1. Umieścić właściwą ilość rozpuszczalników A (2.2) i B (2.3) w komorach dwóch oddzielnych chromatografów w celu wykonania zstępującej chromatografii bibułowej. Nasycać komory chromatograficzne oparami rozpuszczalników przez co najmniej 24 godziny.

5.2. Nanieść po 1 μl jednego roztworu próbki i jednego roztworu odniesienia przygotowanych według opisu w sekcjach 4 i 2.1 na każdy punkt startowy paska bibuły chromatograficznej ("Whatman" nr 3 lub równoważnej) o długości 40 cm i szerokości 20 cm (3.1) lub innego odpowiedniego formatu i odparować rozpuszczalnik na powietrzu.

5.3. Umieścić pasek chromatograficzny (5.2) w komorze chromatograficznej z rozpuszczalnikiem rozwijającym A (5.1) i rozwijać do chwili, kiedy czoło rozpuszczalnika osiągnie odległość 35 cm (około 15 godzin).

5.4. Powtórzyć procedurę opisaną w sekcjach 5.2 i 5.3 z użyciem bibuły chromatograficznej (Whatman nr 4 lub równoważnej) (3.1) i rozpuszczalnika rozwijającego B. Rozdział chromatograficzny prowadzić do chwili, kiedy czoło rozpuszczalnika osiągnie odległość 35 cm (około pięciu godzin).

5.5. Po rozwinięciu wyjąć chromatogramy z komory i wysuszyć na powietrzu.

5.6. Wywołać plamy na chromatogramie przez spryskanie go kolejno:

5.6.1. środkiem wywołującym A (2.4) i następnie, po krótkim czasie, środkiem wywołującym B (2.5). Najpierw pojawiają się na chromatografie plamy nadsiarczanów, a następnie wywołane zostaną plamy nadtlenku wodoru. Obrysować plamy ołówkiem;

5.6.2. środkiem wywołującym C (2.6) chromatogramów otrzymanych zgodnie z opisem w sekcji 5.6.1; szaroniebieskie plamy na chromatogramie wskazują na obecność bromianów.

5.7. W opisanych powyżej warunkach, właściwych dla rozpuszczalników rozwijających A (2.2) i B (2.3), wartości Rf dla substancji odniesienia (2.l) są w przybliżeniu następujące:

	Roztwór rozwijający A (2.2)	Roztwór rozwijający B (2.3)
Nadsiarczan sodu	0,40	0,10
Nadsiarczan potasu	0,40	0,02 + 0,05
Nadsiarczan amonu	0,50	0,10 + 0,20
Bromian sodu	0,40	0,20
Bromian potasu	0,40	0,10 + 0,20
Nadtlenek wodoru	0,80	0,80

B.

IDENTYFIKACJA NADTLENKU BARU

1. ZASADA

Identyfikację nadtlenku baru wykonuje się na podstawie powstawania nadtlenku wodoru po zakwaszeniu próbki (A.4.2) oraz na podstawie stwierdzenia obecności jonu baru:

- w przypadku nieobecności nadsiarczanów (A) - przez dodanie rozcieńczonego kwasu siarkowego do części kwaśnego roztworu próbki (B.4.1), w wyniku czego powstaje biały osad siarczanu baru. Obecność jonów baru w próbce (B.4.l) potwierdza się ponownie za pomocą chromatografii bibułowej według metody opisanej poniżej (B.5),

- w przypadku, gdy w próbce obecne są równocześnie nadtlenek baru i nadsiarczany (B.4.2), obecność jonów baru w roztworze stopu (B.4.2.3) stwierdza się przez rozpuszczenie pozostałości z roztworu (B.4.2), w podwyższonej temperaturze i w środowisku alkalicznym; po rozpuszczeniu w kwasie chlorowodorowym, za pomocą metody chromatografii bibułowej i/lub przez wytrącenie osadu siarczanu baru.

2. ODCZYNNIKI

2.1. Metanol

2.2. 36-procentowy (m/m) stężony kwas chlorowodorowy

2.3. 6 N kwas chlorowodorowy

2.4. 4 N kwas siarkowy

2.5. Sól dwusodowa kwasu rodyzonowego (3,4,5,6-tetraoksocyklohekseno-l,2-diolu).

2.6. Chlorek baru (BaCl₂ · 2H₂ O)

2.7. Bezwodny węglan sodu

2.8. l-procentowy (m/v) roztwór wodny chlorku baru

2.9. Rozpuszczalnik rozwijający zawierający metanol, stężony kwas chlorowodorowy (stężenie 36 %) i wodę (80:10:10 obj.)

2.10. Środek wywołujący, 0,1-procentowy (m/v) roztwór wodny soli dwusodowej kwasu rodyzonowego, świeżo przygotowany bezpośrednio przez użyciem.

3. APARATURA I WYPOSAŻENIE

3.1. Mikropipeta, 5 μl

3.2. Tygle platynowe

3.3. Kolby miarowe, 100 ml

3.4. Bibuła chromatograficzna firmy "Schleicher and Schull" 2043b lub równoważna. Bibułę oczyszcza się przez pozostawienie jej na noc w komorze chromatograficznej (A.3.5) zawierającej rozpuszczalnik rozwijający (B.2.9), a następnie suszy się ją.

3.5. Karbowany sączek bibułowy.

3.6. Aparatura do zstępującej chromatografii bibułowej.

4. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI

4.l. Produkty niezawierające nadsiarczanów

4.1.1. Zawiesić 2 g produktu w 50 ml wody i doprowadzić kwasem chlorowodorowym (B.2.3) pH dyspersji do wartości około l.

4.1.2. Za pomocą wody przenieść dyspersję do 100-mililitrowej kolby miarowej, uzupełnić wodą do kreski i wymieszać. Dyspersji tej używa się do analizy metodą chromatografii bibułowej opisanej w sekcji 5 oraz do identyfikacji baru przez wytrącenie siarczanu.

4.2. Produkty zawierające nadsiarczany

4.2.1. Zawiesić 2 g produktu w 100 ml wody i przesączyć.

4.2.2. Do wysuszonej pozostałości dodać siedem do dziesięciu razy więcej wagowo węglanu sodu (B.2.7), wymieszać i stapiać mieszaninę w tyglu platynowym (B.3.2) przez pół godziny.

4.2.3. Schłodzić do temperatury pokojowej, rozpuścić stop w 50 ml wody i przesączyć (B.3.5).

4.2.4. Rozpuścić pozostałość ze stopu w kwasie chlorowodorowym (B.2.3) i uzupełnić wodą do 100 ml. Roztworu tego używa się do analizy metodą chromatografii bibułowej, opisaną w sekcji 5, oraz do identyfikowania obecności baru przez wytrącenie siarczanu.

5. METODA

5.1. Umieścić właściwą ilość rozpuszczalnika rozwijającego (B.2.9) w komorze do zstępującej chromatografii bibułowej i nasycać komorę przez co najmniej 15 godzin.

5.2. Na kawałku bibuły chromatograficznej - przygotowanej tak jak opisano w sekcji B.3.4 - nanieść po 5 μl każdego roztworu, przygotowanego zgodnie ze wskazówkami przedstawionymi w sekcjach B.4.l.2 i B.4.2.4, oraz roztwór odniesienia B.2.8 w trzech punktach startowych.

5.3. Wysuszyć bibułę z naniesionymi próbkami i roztworem odniesienia na powietrzu. Rozwijać chromatogram do chwili, kiedy czoło rozpuszczalnika osiągnie 30 cm.

5.4. Wyjąć chromatogram z komory i wysuszyć na powietrzu.

5.5. Wywołać plamy na chromatogramie przez spryskanie bibuły środkiem wywołującym B.2.10. W przypadku obecności baru na chromatogramie pojawiają się czerwone plamy o wartości RF około 0,10.

C.

OZNACZENIE NADTLENKU WODORU

1. ZASADA

Jodometryczne oznaczanie nadtlenku wodoru przeprowadza się według następującej reakcji:

H₂O₂ + 2H⁺ + 2I^- → I₂ - 2H₂O

Przemiana ta zachodzi powoli, lecz można ją przyspieszyć przez dodanie heptamolibdenianu (VI) amonu. Ilość powstałego jodu oznacza się miareczkowo tiosiarczanem sodu i stanowi ona miarę zawartości nadtlenku wodoru.

2. DEFINICJA

Zawartość nadtlenku wodoru oznaczona w sposób opisany poniżej jest wyrażona jako procent masowy (% m/m) produktu.

3. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki powinny być czyste do analizy.

3.1. 2 N kwas siarkowy

3.2. Jodek potasu

3.3. Heptamolibdenian (VI) amonu

3.4. 0,1 N tiosiarczan sodu

3.5. 10-procentowy (m/v) roztwór jodku potasu, świeżo przygotowany bezpośrednio przez użyciem

3.6. 20-procentowy (m/v) roztwór heptamolibdenianu (VI) amonu

3.7. l-procentowy (m/v) roztwór skrobi

4. APARATURA I WYPOSAŻENIE

4.1. Zlewki, 100 ml

4.2. Biureta, 50 ml

4.3. Kolby miarowe, 250 ml

4.4. Cylindry miarowe, 25 i 100 ml

4.5. Pipety jednomiarowe, 10 ml

4.6. Kolby stożkowe, 250 ml

5. METODA

5.1. W zlewce 100-mililitrowej odważyć około 10 g (m gramów) produktu zawierającego około 0,6 g nadtlenku wodoru. Przenieść zawartość zlewki za pomocą wody do kolby miarowej 250-mililitrowej, uzupełnić wodą do kreski i wymieszać.

5.2. Odmierzyć pipetą 10 ml roztworu próbki (5.1) do 250-mililitrowej kolby stożkowej (4.6) i dodawać kolejno 100 ml 2N kwasu siarkowego (3.1), 20 ml roztworu jodku potasu (3.5) i trzy krople roztworu heptamolibdenianu (VI) amonu (3.6).

5.3. Miareczkować powstały jod bezzwłocznie 0,1N roztworem tiosiarczanu sodu (3.4) i bezpośrednio przed osiągnięciem punktu końcowego dodać kilka mililitrów roztworu skrobi (3.7) jako wskaźnika. Zarejestrować zużycie 0,1N roztworu tiosiarczanu sodu (3.4) w mililitrach (V).

5.4. Przeprowadzić analizę ślepej próby według sposobu opisanego w sekcji 5.2 i 5.3, zastępując 10 ml roztworu próbki 10 ml wody. Zarejestrować zużycie 0,1N roztworu tiosiarczanu sodu w analizie ślepej próby (V_o ml).

6. OBLICZENIE

Obliczyć zawartość nadtlenku wodoru w produkcie, w procentach masowych (% m/m), według następującego wzoru:

% nadtlenku wodoru

gdzie:

m = ilość produktu poddawanego analizie (5.l),

Vo = zużycie 0,1N roztworu tiosiarczanu do analizy ślepej próby w mililitrach (5.4),

V = zużycie 0,1N roztworu tiosiarczanu do analizy roztworu próbki w mililitrach (5.3).

7. POWTARZALNOŚĆ⁽¹⁾

W przypadku produktu zawierającego około 6 % m/m nadtlenku wodoru, różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych równolegle dla tej samej próbki nie powinna przekraczać wartości bezwzględnej 0,2 %.

II.

IDENTYFIKACJA I PÓŁILOŚCIOWE OZNACZANIE NIEKTÓRYCH BARWNIKÓW UTLENIAJĄCYCH W FARBACH DO WŁOSÓW

1. CEL I ZAKRES

Metoda jest odpowiednia do identyfikacji i półilościowego oznaczania następujących substancji w farbach do włosów, w postaci kremu lub płynu:

Substancje	Symbol
Fenylenodwuaminy
o-fenylenodwuamina	(OPD)
m-fenylenodwuamina	(MPD)
p-fenylenodwuamina (załącznik V)	(PPD)
Metylofenylenodwuaminy
4-metylo-1,2-fenylenodwuamina (3,4-dwuaminotoluen)	(OTD)
4-metylo-1,3-fenylenodwuamina (2,4-dwuaminotoluen)	(MTD)
2-metylo-l,4-fenylenodwuamina (2,5 dwuaminotoluen)	(PTD)
Dwuaminofenole
2,4-dwuaminofenol	(DAP)
Hydrochinon
1,4-dwuhydroksybenzen	(H)
a-naftol	(α-N)
Pirogalol
1,2,3-trójhydroksybenzen	(P)
Rezorcynol
1,3-dwuhydroksybenzen	(R)

2. ZASADA

Barwniki utleniające z farb w postaci kremu lub płynu ekstrahuje się za pomocą 96-procentowego alkoholu etylowego oraz przy pH = 10 i identyfikuje się je metodą chromatografii cienkowarstwowej, jedno- lub dwukierunkowej.

W celu półilościowego oznaczenia tych substancji, chromatogramy próbek otrzymane za pomocą czterech układów rozwijających są porównywane z chromatogramami substancji odniesienia otrzymanymi w tym samym czasie i w możliwie jak najbardziej podobnych warunkach.

3. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki powinny być czyste do analizy.

3.1 Bezwodny alkohol etylowy

3.2. Aceton

3.3. Alkohol etylowy, 96-procentowy v/v

3.4 Roztwór amoniaku, 25-procentowy,

3.5. Kwas L(+) askorbinowy

3.6. Chloroform

3.7. Cykloheksan

3.8. Azot techniczny

3.9. Toluen

3.10. Benzen

3.11. n-butanol

3.12. Butan-2-ol

3.13. Kwas podfosforawy, roztwór 50-procentowy v/v.

3.14. Odczynnik do dwuazowania. Jeden z dwóch do wyboru:

- chlorobenzenosulfonian-3-nitro-1-benzenodwuazoniowy (stabilizowany w postaci soli), tak jak w Red 2 JN-Francolor

- naftalenobenzoesan-2-chloro-4-nitro-1-benzenodwuazoniowy (stabilizowany w postaci soli), tak jak w odczynniku NNCD - odniesienie nr 74150 FLUKA

lub równoważny.

3.15. Azotan srebra

3.16. p-dwumetyloaminobenzaldehyd

3.17. 2,5-dwumetylofenol

3.18. Sześciowodny chlorek żelazowy

3.19. Kwas chlorowodorowy, roztwór 10-procentowy m/v.

3.20. Substancje odniesienia

Substancje odniesienia przedstawiono w ust. 1 "Cel i zakres". W przypadku związków aminowych substancją odniesienia może być chlorowodorek (mono- lub di-) lub wolna zasada.

3.21. Roztwory odniesienia 0,5-procentowe (m/v).

Przygotowuje się roztwór A 0,5-procentowy (m/v) wszystkich substancji odniesienia podanych w sekcji. 3.20.

Odważyć 50 mg ± 1 mg substancji odniesienia w 10-mililitrowej kolbie miarowej.

Dodać 5 ml 96-procentowego alkoholu etylowego (3.3) i 250 mg kwasu askorbinowego (3.5).

Zalkalizować dodając roztwór amoniaku (3.4), do uzyskania wyraźnego odczynu o pH 10 (zbadać papierkiem wskaźnikowym).

Uzupełnić 96-procentowym alkoholem etylowym (3.3) do 10 ml i wymieszać.

Roztwory można przechowywać przez tydzień, w chłodnym miejscu i bez dostępu światła.

W niektórych przypadkach po dodaniu kwasu askorbinowego i amoniaku może wytrącać się osad. W tej sytuacji przed przystąpieniem do kolejnych czynności należy pozwolić na jego osadzenie się.

3.22. Rozpuszczalniki rozwijające

3.22.1. Aceton - chloroform - toluen (35:25:40 obj.)

3.22.2. Chloroform - cykloheksan - etanol absolutny - 25-procentowy amoniak (80:10:10:1 obj.)

3.22.3. Benzen - butan-2-ol - woda (50:25:25). Po rozdzieleniu w temperaturze pokojowej (20-25 °C), należy dobrze wstrząsnąć i zastosować górną fazę.

3.22.4. Butanol - chloroform - odczynnik M (7:70:23 obj.). Rozdzielać starannie, w temperaturze pokojowej (20-25°C) i stosować dolną fazę.

Przygotowanie odczynnika M:

25-procentowy (v/v) roztwór amoniaku 24 objętości

50-procentowy kwas podfosforawy (3.13) l objętość

woda 75 objętości

Uwaga

Rozpuszczalniki rozwijające zawierające amoniak bezpośrednio przed użyciem należy dobrze wstrząsnąć.

3.23. Wskaźniki wywołujące do rozpylania

3.23.l. Odczynnik do dwuazowania

Przygotować 5-procentowy (m/v) roztwór wodny wybranego odczynnika (3.14). Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.23.2. Odczynnik Ehrlicha

Rozpuścić 2 g p-dwumetyloaminobenzaldehydu (3.16) w 100 ml 10-procentowego (m/v) wodnego roztworu kwasu chlorowodorowego (3.19).

3.23.3. 2,5-dwumetylofenol - chlorek żelaza sześciowodny.

Roztwór1: rozpuścić 1 g dwumetylofenolu (3.17) w 100 ml 96-procentowego etanolu (3.3).

Roztwór 2: rozpuścić 4 g chlorku żelaza sześciowodnego (3.18) w 100 ml 96-procentowego etanolu (3.3).

Do wywoływania roztwory te należy rozpylać oddzielnie, najpierw roztwór l, następnie roztwór 2.

3.23.4. Amoniakalny azotan srebra.

Do 5-procentowego (m/v) wodnego roztworu azotanu srebra (3.15) dodać 25-procentowy amoniak (3.4), aż do rozpuszczenia osadu.

Odczynnik ten musi zostać przygotowany bezpośrednio przed użyciem. Nie należy go przechowywać.

4. APARATURA

4.l. Stosuje się zwykłe wyposażenie laboratoryjne do chromatografii cienkowarstwowej.

4.l.l. Osłona z tworzywa sztucznego lub szklana, skonstruowana tak, aby azot mógł opływać płytkę chromatograficzną podczas nanoszenia kropli próbek i suszenia. Ostrożność ta jest konieczna ze względu na podatność pewnych barwników na utlenianie.

4.1.2. Mikrostrzykawka 10-mikrolitrowa, kalibrowana, z podziałkami 0,2 μl, z okrągło zakończoną igłą, lub lepiej 50-mikrolitrowa, wielokrotny dozownik, zmontowany na statywie śrubowym w taki sposób, że płytka może być utrzymywana w atmosferze azotu.

4.l.3. Cienkowarstwowe płytki krzemionkowe gotowe do stosowania, o grubości 0,25 mm, o wymiarach 20 × 20 cm (firmy Macherey and Nagel, Silica G-HR, które mają podłoże ze sztucznego tworzywa, lub płytki równoważne).

4.2. Wirówka, 4.000 obrotów/minuta.

4.3. Probówki do wirówki, 10-mililitrowe z korkiem gwintowym pokrytym PTFE lub probówki równoważne.

5. PROCEDURA

5.1. Przygotowanie próbek

Odrzucić pierwsze 2 lub 3 cm kremu wyciśniętego z tuby.

W probówce wirówki (4.3), uprzednio przepłukanej azotem, umieścić: 300 mg kwasu askorbinowego, 3 g kremu lub 3 g homogenizowanego płynu.

Wkraplać 25-procentowy amoniak (3.4) do uzyskania pH 10. Uzupełnić 96-procentowym alkoholem etylowym (3.3) do 10 ml.

Homogenizować w atmosferze azotu (3.8), zamknąć i następnie wirować przy 4.000 obrotów na minutę przez 10 minut.

Do analizy stosować ciecz znajdującą się na górze.

5.2. Chromatografia

5.2.l. Nanoszenie kropli na płytki

W atmosferze azotu (3.8), nanieść na płytkę chromatograficzną (4.l.3) po 1 μl wszystkich opisanych powyżej roztworów odniesienia, w dziewięciu punktach, oddalonych od siebie o 1,5 cm, wzdłuż linii znajdującej się średnio 1,5 cm od krawędzi płytki.

Roztwory odniesienia należy rozmieścić następująco:

1	2	3	4	5	6	7	8	9
R	P	H	PPD	DAP	PTD	OPD	OTD	MPD
MTD	α-N

Dodatkowo nanieść w punktach 10 i 11 odpowiednio po 2 μl próbek badanych roztworów, otrzymanych zgodnie z opisem w sekcji. 5.1.

Utrzymywać płytkę w atmosferze azotu, aż do chwili, kiedy zostanie poddana rozdziałowi chromatograficznemu.

5.2.2. Rozwijanie

Umieścić płytkę w komorze uprzednio przepłukanej azotem (3.8), nasyconej jednym z czterech rozpuszczalników (3.22) i pozostawić do rozwijania w temperaturze pokojowej (20-25°C) w ciemności, do chwili, kiedy czoło rozpuszczalnika osiągnie wysokość około 15 cm od linii bazowej.

Wyjąć płytkę z komory i suszyć w atmosferze azotu (3.8), w temperaturze pokojowej.

5.2.3. Spryskiwanie

Spryskać płytkę bezzwłocznie jednym z czterech roztworów wymienionych w punkcie 3.23.

5.2.4. Identyfikacja

Porównać wartości R_f i barwy otrzymanych plam z tymi otrzymanymi dla substancji odniesienia poddanej chromatograficznemu rozdziałowi.

Tabela I podaje przykłady wartości R_f i barwy dla każdej substancji, zależnie od stosowanych rozpuszczalników i użytych wskaźników wywołujących.

Potwierdzenie wątpliwej identyfikacji można czasem uzyskać metodą wzorca wewnętrznego, dodając roztwór odpowiedniej substancji odniesienia do ekstraktu próbki.

5.2.5. Ocena półilościowa

Porównać wizualnie intensywność plam dla każdej substancji identyfikowanej w punkcie 5.2.4 z odpowiednim zakresem stężeń substancji odniesienia.

Jeśli stężenie jednej lub kilku substancji znalezionych w próbce jest zbyt wysokie, rozcieńczyć ekstrakt próbki i powtórzyć pomiar.

TABELA I

Wartości Rf i barwy otrzymane bezpośrednio po spryskaniu.

Substancja	Rozpuszczalniki rozwijające				Rozpylane wskaźniki wywołujące
odniesienia	Wartości Rf				Otrzymane barwy
(3.20)	(3.22.1)	(3.22.2)	(3.22.3)	(3.22.4)	Dwuazowy (3.23.1)	Ehrlicha (3.23.2)	Dwumetylofenol (3.23.3)	AgNO3 (3.24.4)
OPD	0,62	0,60	0,30	0,57	blado-brązowa	-	-	bladobrązowa
MPD	0,40	0,60	0,47	0,48	fioletowo-brązowa(*)	żółta	bladobrązowa	bladobrązowa
PPD	0,20	0,50	0,30	0,48	brązowa	jasnoczerwona*	fioletowa	szara
OTO	0,60	0,60	0,53	0,60	brązowa(*)	bladopomarańczowa	bladobrązowa	szarawobrązowa
MTD	0,40	0,67	0,45	0,60	czerwonawobrązowa(*)	żółta	brązowa	czarna
PTD	0,33	0,65	0,37	0,70	brązowa	pomarańczowa	fioletowa(*)	szara
DAP	0,07	-	0	0,05	brązowa(*)	pomarańczowa	fioletowa	brązowa
H	0,50	0,35	0,80	0,20	-	pomarańczowa	fioletowa	czarna(*)
a-N	0,90	0,80	0,90	0,75	pomarańczowobrązowa	-	fioletowa fioletowa(*)	czarna
P	0,37	-	0,67	0,05	brązowa	bardzo lekko blado fioletowa	bardzo lekko bladobrązowa	brązowa*
R	0,50	0,37	0,80	0,17	pomarańczowa*	bladofioletowa	bardzo lekko bladobrązowa	bladobrązowa
Uwaga: l. OPD jest słabo widoczna, należy użyć rozpuszczalnika (3.22.3), aby rozdzielić ją wyraźnie od OTD. 2. (*) Wskazuje najlepszą wywołaną barwę.

6. BADANIE METODĄ DWUKIERUNKOWEJ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ

Procedura chromatografii dwukierunkowej wymaga zastosowania dodatkowych wzorców i odczynników.

6.1. Dodatkowe roztwory i substancje odniesienia:

6.1.1. β-naftol (B-N)

6.1.2 2-aminofenol (OAP)

6.1.3. 3-aminofenol (MAP)

6.1.4. 4-aminofenol (PAP)

6.1.5. 2-nitro-l,4-fenylenodwuamina (2-NPPD)

6.1.6. 4-nitro-l,2-fenylenodwuamina (4-NOPD)

Przygotować 0,5-procentowe m/v roztwory wszystkich dodatkowych substancji odniesienia, według wskazówek przedstawionych w punkcie 3.21.

6.2. Dodatkowy rozpuszczalnik rozwijający

6.2.l. Octan etylu - cykloheksan - 25-procentowy roztwór amoniaku (65:30:0,5 obj.).

6.3. Dodatkowy układ wskaźnika wywołującego

Umieścić szklane naczynie w komorze do chromatografii cienkowarstwowej, dodać około 2 g kryształów jodu i zamknąć komorę odpowiednią pokrywką.

6.4. Chromatografia

6.4.1. Na powierzchni absorbentu płytki cienkowarstwowej (4.1.3) narysować dwie linie, tak jak pokazano na rysunku 1.

6.4.2. W atmosferze azotu (4.1.1) nanieść od 1 do 4 μl ekstraktu (5.1) w punkcie bazowym 1 (rys. 1), który znajduje się w odległości 2 cm od obu krawędzi. Ilość naniesionego ekstraktu zależy od intensywności plam na chromatogramach 5.2.

6.4.3. Między punktami 2 i 3 (rys. 1) rozdzielić barwniki utleniające, zidentyfikowane lub do identyfikacji, przez rozdział chromatograficzny 5.2 (odległość między punktami wynosi 1,5 cm). Nanosić po 2 μl wszystkich roztworów odniesienia, z wyjątkiem DAP, który trzeba nanieść w ilości 6 μl. Czynności należy wykonywać w atmosferze azotu (6.4.2).

6.4.4. Powtórzyć operację 6.4.3 w punktach bazowych 4 i 5 (rys. 1) i utrzymywać płytkę w atmosferze azotu, aż do chwili rozpoczęcia rozdziału chromatograficznego (odległość między punktami wynosi 1,5 cm).

6.4.5. Przepłukać komorę chromatograficzną azotem (3.8) i umieścić w niej odpowiednią ilość rozpuszczalnika rozwijającego 3.22.2. Umieścić płytkę (6.4.4) w komorze i rozwinąć ją w ciemności w pierwszym kierunku elucji (rys. 1) w ciemności.

Eluować do chwili, kiedy czoło rozpuszczalnika osiągnie linię zaznaczoną na płytce (około 13 cm).

6.4.6. Wyjąć płytkę z komory i umieścić ją w komorze chromatograficznej przepłukanej uprzednio azotem, co najmniej na 60 minut, w celu odparowania wymywanego rozpuszczalnika.

6.4.7. Przy pomocy kalibrowanej probówki wprowadzić do komory przepłukanej azotem (3.8) odpowiednią ilość rozpuszczalnika wymywającego (6.2), umieścić płytkę obróconą o 90° w komorze (6.4.6) i prowadzić rozdział chromatograficzny w drugim kierunku (również w ciemności) do chwili, kiedy czoło rozpuszczalnika osiągnie linię narysowaną na powierzchni absorbentu. Wyjąć płytkę z komory i odparować rozpuszczalnik wymywający na powietrzu.

6.4.8. Umieścić płytkę w komorze chromatograficznej z parami jodu (6.3) na 10 minut i interpretować dwukierunkowy chromatogram korzystając z wartości Rf i barw substancji odniesienia, rozdzielanych chromatograficznie w tym samym czasie (tabela II stanowi przewodnik po wartościach Rf i barwach).

Uwaga

W celu maksymalnego wybarwienia plam chromatogram należy pozostawić wystawiony na działanie powietrza na pół godziny po rozwinięciu.

6.4.9. Obecność barwników utleniających stwierdzoną w punkcie 6.4.8 można ostatecznie potwierdzić przez powtórzenie czynności opisanych w punktach 6.4.1-6.4.8, oraz przez dodanie w 1 punkcie bazowym do ilości ekstraktu podanej w punkcie 6.4.2, 1 μl substancji odniesienia zidentyfikowanej w 6.4.8. Jeśli nie zostanie znaleziona dodatkowa plama w porównaniu z chromatogramem otrzymanym według punktu 6.4.8, interpretacja chromatogramu 6.4.8. jest prawidłowa.

TABELA II

Barwa substancji odniesienia po procesie chromatografii i wywołaniu parami jodu

Substancja odniesienia	Barwa po wywołaniu parami jodu
R	beżowa
P	brązowa
alfa-N	fioletowa
beta-N	bladobrązowa
H	fioletowo-brązowa
MPD	żółtawobrązowa
PPD	fioletowo-brązowa
MTD	ciemnobrązowa
PTD	żółtawobrązowa
DAP	ciemnobrązowa
OAP	pomarańczowa
MAP	żółtawobrązowa
PAP	fioletowo-brązowa
2-NPPD	brązowa
4-NOPD	pomarańczowa

grafika

III.

IDENTYFIKACJA I OZNACZANIE AZOTYNÓW

A.

IDENTYFIKACJA

1. CEL I ZAKRES

Metoda jest odpowiednia do identyfikowania azotynu w produktach kosmetycznych, szczególnie w kremach i pastach.

2. ZASADA

Na obecność azotynu wskazuje powstawanie barwnych pochodnych z fenylohydrazonem aldehydu 2-aminobenoesowego (Nitrin®).

3. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki powinny być czystości analitycznej.

3.1. Rozcieńczony kwas siarkowy: rozcieńczyć 2 ml stężonego kwasu siarkowego w 11 ml destylowanej wody

3.2. Rozcieńczony kwas chlorowodorowy: rozcieńczyć 1 ml stężonego kwasu chlorowodorowego w 11 ml destylowanej wody.

3.3. Metanol

3.4. Roztwór fenylohydrazonu aldehydu 2-aminobenzoesowego (odczynnik Nitrin®) w metanolu.

Odważyć 2,0 g Nitrinu® i przenieść ilościowo do 100-mililitrowej kolby miarowej. Dodać kroplami 4 ml rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego (3.2) i wstrząsnąć. Uzupełnić do kreski metanolem i mieszać do chwili, kiedy roztwór stanie się całkowicie przeźroczysty. Przechowywać roztwór w brązowej szklanej butli (4.3).

4. APARATURA

4.1. Zlewki, 50 ml

4.2. Kolba miarowa, 100 ml

4.3. Butla z brązowego szkła, 125 ml

4.4. Płytka szklana, 10 × 10 cm

4.5. Łopatka z tworzywa sztucznego

4.6. Bibuła filtracyjna, 10 × 10 cm

5. PROCEDURA

5.1. Rozsmarować część badanej próbki równomiernie na szklanej płytce (4.4), aby pokryć powierzchnię do grubości nie większej niż 1 cm.

5.2. Zanurzyć arkusz bibuły filtracyjnej (4.6) w wodzie destylowanej. Położyć bibułę na próbce i przycisnąć łopatką z tworzywa sztucznego (4.5).

5.3. Odczekać około jednej minuty i nanieść na środek bibuły filtracyjnej:

- krople rozcieńczonego kwasu siarkowego (3.1),

- następnie dwie krople roztworu Nitrinu® (3.4).

5.4. Po czasie od 5 do 10 sekund zdjąć bibułę filtracyjną i obejrzeć w świetle dziennym. Czerwonawopurpurowe zabarwienie wskazuje na obecność azotynu.

Jeśli zawartość azotynu jest niewielka, czerwonawopurpurowa barwa zmienia się w żółtą po upływie od 5 do 15 sekund. Jeżeli zawartość azotynu jest niska, zmiana barwy z czerwonawopurpurowej na żółtą następuje po upływie 15 sekund. Ta zmiana ma miejsce tylko po czasie od jednej do dwóch minut, w przypadku dużej zawartości azotynów.

6. UWAGA

Intensywność czerwonawopurpurowej barwy i czas, który upływa przed jej zmianą na żółtą, może być wskaźnikiem zawartości azotynu w próbce.

B.

OZNACZANIE

1. CEL

Metoda opisuje oznaczanie azotynów w produktach kosmetycznych.

2. DEFINICJA

Zawartość azotynów w próbce oznaczona zgodnie z niniejszą metodą jest wyrażona w % masowych azotynu sodu.

3. ZASADA

Po rozcieńczeniu próbki wodą i wyklarowaniu roztworu azotan obecny w próbce poddany zostaje reakcji z sulfaniloamidem i N-1-naftyloetylenodwuaminą, a gęstość optyczną otrzymanej barwy oznacza się przy 538 nm.

4. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki powinny być czystości analitycznej.

4.l. Odczynniki klarujące: odczynniki te nie mogą być używane dłużej niż przez tydzień od momentu ich przygotowania.

4.1.1. Odczynnik I Carreza:

Rozpuścić 106 g 3'hydratu żelazocyjanku (II) potasowego K₄Fe(CN)₆ · 3H₂O w wodzie destylowanej i rozcieńczyć wodą do 1.000 ml.

4.1.2. Odczynnik II Carreza:

Rozpuścić 219,5 g octanu cynku Zn(CH₃COO)₂ · 2H₂O i 30 ml lodowatego kwasu octowego w wodzie destylowanej i rozcieńczyć wodą do 1.000 ml.

4.2. Roztwór azotynu (ES) sodu:

Rozpuścić 0,500 g azotynu sodu w wodzie destylowanej w kolbie miarowej 1.000-mililitrowej i rozcieńczyć wodą do kreski, rozcieńczyć 10,0 ml tego bazowego standardowego roztworu do 500 ml, 1 ml tego roztworu = 10 mikrogramów NaNO₂.

4.3. 1N roztwór wodorotlenku sodu

4.4. 0,2-procentowy chlorowodorku sulfaniloamidu:

Rozpuścić 2,0 g sulfaniloamidu w 800 ml wody przez ogrzewanie. Schłodzić i dodać 100 ml stężonego kwasu chlorowodorowego, równocześnie mieszając. Rozcieńczyć wodą do 1.000 ml.

4.5. 5 N kwas chlorowodorowy

4.6. Odczynnik N-1- naftyl

Ten roztwór musi zostać przygotowany w dniu zastosowania. Rozpuścić 0,1 g dwuchlorowodorku N-lnaftyloetylenodwuaminy w wodzie i rozcieńczyć wodą do 100 ml.

5. APARATURA

5.1. Waga analityczna

5.2. Kolby miarowe o pojemności 100, 250, 500 i 1.000 ml

5.3. Pipety ze zbiornikiem lub kalibrowane

5.4. Cylindry miarowe, 100 ml

5.5. Sączki filtracyjne karbowane o średnicy 15 cm, niezawierające azotynów

5.6. Łaźnia wodna

5.7. Spektrofotometr z naczynkami optycznymi o długości drogi optycznej 1 cm.

5.8. Pehametr

5.9. Mikrobiureta, 10 ml

5.10. Zlewki, 250 ml

6. PROCEDURA

6.1. Odważyć około 0,5 g (m gramów) homogenizowanej próbki, z dokładnością do 0,1 mg, przenieść za pomocą gorącej wody destylowanej ilościowo do 250 ml zlewki (5.10) i uzupełnić objętość gorącą wodą destylowaną do około 150 ml. Umieścić zlewkę (5.10) w łaźni wodnej (5.6) o temperaturze 80 °C na pół godziny. Podczas tego okresu od czasu do czasu wstrząsnąć zawartość.

6.2. Schłodzić do temperatury pokojowej i dodawać kolejno, równocześnie mieszając, 2 ml odczynnika I Carreza (4.1.1) i 2 ml odczynnika II Carreza (4.1.2).

6.3. Dodawać 1N roztwór wodorotlenku sodu (4.3), aż do uzyskania pH 8,3. (Używać pehametru (5.8)). Przenieść zawartość ilościowo do 250-mililitrowej kolby miarowej (5.2) i uzupełnić do kreski wodą destylowaną.

6.4. Wymieszać zawartość i przesączyć przez sączek karbowany (5.5).

6.5. Przenieść pipetą (5.3) odpowiednią podwielokrotność (V ml) klarownego filtratu, lecz nie więcej niż 25 ml, do 100-mililitrowej kolby miarowej (5.2) i dodać wodę destylowaną do objętości 60 ml.

6.6. Po zmieszaniu dodać 10,0 ml roztworu chlorowodorku sulfaniloamidu (4.4), a następnie 6,0 ml 5N roztworu kwasu chlorowodorowego (4.5). Wymieszać i pozostawić do odstania na pięć minut. Dodać 2 ml odczynnika N-1 naftylowego (4.6), wymieszać i pozostawić do odstania na trzy minuty. Rozcieńczyć wodą do kreski i wymieszać.

6.7. Przygotować ślepą próbę, powtarzając czynności 6.5 i 6.6, bez dodawania odczynnika N-1-naftylowego (4.6).

6.8. Zmierzyć za pomocą spektrofotometru (5.7) gęstość optyczną przy 538 nm roztworu otrzymanego według punktu 6.6, z zastosowaniem roztworu do ślepej próby (6.7) jako odniesienia.

6.9. Odczytać z wykresu kalibracyjnego (6.10) zawartość azotynu sodu w mikrogramach na 100 ml roztworu (m₁ mikrogramów), która odpowiada gęstości optycznej zmierzonej w punkcie 6.8.

6.10. Przygotować wykres kalibracyjny dla stężeń 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg azotynu sodu w 100 ml, stosując roztwór azotynu sodu o stężeniu 10 μl na ml (4.2).

7. OBLICZENIE

Obliczyć zawartość azotynu sodu w procentach masowych, za pomocą następującego wzoru:

gdzie:

m = masa próbki pobranej do analizy w gramach (6.1),

m₁ = zawartość azotynu sodu w mikrogramach oznaczona w punkcie 6.9,

V = ilość mililitrów filtratu użytego do pomiaru (6.5).

8. POWTARZALNOŚĆ⁽¹⁾

Dla zawartości około 0,2-procentowego m/m azotynu sodu różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie powinna przekroczyć wartości absolutnej 0,005 %.

IV.

IDENTYFIKACJA I OZNACZANIE WOLNEGO FORMALDEHYDU

1. CEL I ZAKRES

Niniejsza metoda opisuje identyfikację oraz dwa rodzaje oznaczania obecności donorów formaldehydu. Metoda może służyć do badania wszystkich produktów kosmetycznych.

1.1. Identyfikacja

1.2. Ogólne oznaczanie metodą kolorometryczną z pentano-2,4-dionem

Niniejsza metoda ma zastosowanie, gdy formaldehyd jest używany w czystej postaci lub z innymi konserwantami, które nie są donorami formaldehydu.

W przeciwnym przypadku oraz gdy wyniki wykazują przekroczenie maksymalnego dozwolonego stężenia, musi zostać zastosowana następująca metoda potwierdzająca obecność.

1.3. Oznaczanie w obecności donorów formaldehydu

W metodzie opisanej powyżej (ppkt 1.2) podczas derywatyzacji donory formaldehydu dzielą się, co prowadzi do zawyżania wyników (formaldehyd związany i spolimeryzowany).

Niezbędne jest oddzielenie wolnego formaldehydu za pomocą chromatografii cieczowej.

2. DEFINICJA

Zawartość wolnego formaldehydu w próbce, oznaczona według tej metody, jest wyrażona w procentach masowych.

3. IDENTYFIKACJA

3.1. Zasada

Wolny oraz związany formaldehyd w środowisku kwasu siarkowego nadaje odczynnikowi Schiffa barwę różową lub fioletowo-różową.

3.2. Odczynniki

Wszystkie odczynniki powinny być analitycznej czystości, woda zaś musi być demineralizowana.

3.2.1. Fuksyna;

3.2.2. Siarczyn sodu uwodniony 7 H₂O;

3.2.3. Stężony kwas solny (d = 1,19);

3.2.4. Kwas siarkowy, ok. 1 M;

3.2.5. Odczynnik Schiffa:

Należy odważyć do zlewki 100 mg fuksyny (ppkt 3.2.1), po czym rozpuścić w 75 ml wody przy temperaturze 80 °C. Po ostudzeniu należy dodać 2,5 g siarczynu sodu (ppkt 3.2.2). Dopełnić do 100 ml.

Odczynnik należy wykorzystać w ciągu dwóch tygodni.

3.3. Procedura

3.3.1. Odważyć do 10 ml zlewki 2 g próbki.

3.3.2. Dodać dwie krople kwasu siarkowego (ppkt 3.2.4) oraz 2 ml odczynnika Schiffa (ppkt 3.2.5). Przed próbą odczynnik Schiffa musi być bezwzględnie bezbarwny.

Należy wstrząsnąć i pozostawić na pięć minut.

3.3.3. Jeśli w ciągu pięciu minut będzie można zaobserwować różowy lub fioletowo-różowy odcień, formaldehyd jest obecny w nadmiarze ponad 0,01 %, który musi zostać oznaczony metodą wolną i wiązaną (pkt 4) i, jeśli to konieczne, musi zostać poddany procedurze (pkt 5).

4. OGÓLNE OZNACZANIE METODĄ KOLOROMETRYCZNĄ Z PENTANO-2,4-DIONEM

4.1. Zasada

Formaldehyd reaguje z pentano-2,4-dionem w obecności octanu amonu i tworzy 3,5-diacetylo-1,4-dihydrolutydynę. Za pomocą butan-1-olu dokonuje się ekstrakcji, po czym mierzy gęstość optyczną ekstraktu przy 410 nm.

4.2. Odczynniki

Wszystkie odczynniki muszą być czystości analitycznej, woda musi być demineralizowana.

4.2.1. Bezwodny octan amonowy;

4.2.2. Stężony kwas octowy, d²⁰₄ = 1, 05;

4.2.3. Pentan-2,4-dion świeżo destylowany pod zredukowanym ciśnieniem 25 mm Hg w temperaturze 25 °C - nie powinien wykazywać absorpcji w 410 nm.

4.2.4. Butan-1-ol;

4.2.5. Kwas solny, 1 M;

4.2.6. Kwas solny, ok. 0,1 M;

4.2.7. Wodorotlenek sodu, 1 M;

4.2.8. Świeżo przygotowany roztwór skrobi, przygotowany zgodnie z Europejską Farmakopeą (1 g/50 ml wody), druga edycja 1980, część I-VII-1-1;

4.2.9. Formaldehyd o stężeniu masowym 37-40 %;

4.2.10. Standardowy roztwór jodu, 0,05 M;

4.2.11. Standardowy roztwór tiosiarczanu sodu, 0,1 M;

4.2.12. Odczynnik pentan 2,4-dion:

W 1.000 mm kolbie miarowej należy rozpuścić:

- 150 g octanu amonu (ppkt 4.2.1),

- 2 ml pentan-2,4-dionu (ppkt 4.2.3),

- 3 ml kwasu octowego (ppkt 4.2.2).

Dopełnić wodą do 1.000 ml (pH roztworu ok. 6,4).

Odczynnik musi być świeżo przygotowany;

4.2.13. Odczynnik (ppkt 4.2.12) bez pentan-2,4-dionu;

4.2.14. Standardowy formaldehyd: roztwór podstawowy

Należy wlać 5 g formaldehydu (ppkt 4.2.9) do 1.000 ml kolby miarowej i dopełnić wodą do 1.000 ml.

Stężenie roztworu należy oznaczyć w następujący sposób:

Należy odlać 10 ml; dodać 25 ml standardowego roztworu jodu (ppkt 4.2.10) oraz 10 ml roztworu wodorotlenku sodu (ppkt 4.2.7),

po czym odstawić na pięć minut.

Następnie należy zakwasić 11,00 ml kwasu solnego (ppkt 4.2.5) i oznaczyć nadmiar jodu za pomocą standardowego roztworu tiosiarczanu sodu (ppkt 4.2.11), używając jako wskaźnika roztworu skrobi (ppkt 4.2.8).

1 ml z 0,05 M zużytego jodu (ppkt 4.2.10) jest równy 1,5 mg formaldehydu;

4.2.15. Standardowy formaldehyd: roztwór rozcieńczony

Należy rozcieńczyć stopniowo wodą podstawowy roztwór formaldehydu w proporcjach 1/20, a potem 1/100.

1 ml tego roztworu zawiera ok. 1 μg formaldehydu.

Obliczyć dokładną zawartość.

4.3. Aparatura

4.3.1. Standardowe wyposażenie laboratoryjne;

4.3.2. Sączek do rozdziału faz, bibuła Whatman 1 PS (lub równoważna);

4.3.3. Wirówka;

4.3.4. Kąpiel wodna ustawiona na 60 °C;

4.3.5. Spektrofotometr;

4.3.6. Naczynka szklane o długości ścieżki optycznej 1 cm.

4.4. Procedura

4.4.1. Roztwór próbki

W 100 ml kolbie miarowej zważyć z dokładnością do 0,001 g ilość (w g) próbki analitycznej, odpowiadającą przypuszczalnej zawartości formaldehydu, czyli około 150 μg.

Uzupełnić wodą do 100 ml i wymieszać (roztwór S).

(Sprawdzić, czy pH jest zbliżone do 6; jeśli nie, należy rozcieńczyć roztworem kwasu solnego (ppkt 4.2.6)).

Do 50 ml kolby stożkowej Erlenmeyera dodać:

- 10,00 ml roztworu S,

- 5,00 ml odczynnika pentano-2,4-dionu (ppkt 4.2.12).

- wodę demineralizowaną do końcowej objętości 30 ml.

4.4.2. Roztwór odniesienia

Możliwe zaburzenia wyników związane z podstawowym kolorem próbki analitycznej należy wyeliminować poprzez zastosowanie roztworu odniesienia:

Do 50 ml kolby stożkowej należy wlać:

- 10,00 ml roztworu S,

- 5, 00 ml odczynnika (ppkt 4.2.13),

- demineralizowaną wodę do końcowej objętości 30 ml.

4.4.3. Próba ślepa

Do 50 ml kolby stożkowej Erlenmeyera dodać:

- 5, 00 ml odczynnika pentano-2,4-dion (ppkt 4.2.12),

- wodę demineralizowaną do końcowej objętości 30 ml.

4.4.4. Oznaczanie

4.4.4.1. Wstrząsać mieszaniny ppkt 4.4.1, 4.4.2 oraz 4.4.3. i zanurzyć na dokładnie 10 minut w łaźni wodnej, w temperaturze 60 °C. Pozostawić do schłodzenia na dwie minuty w łaźni wodnej z lodem.

4.4.4.2. Przenieść mieszaniny do 50 ml rozdzielaczy zawierających po 10,00 ml butan-1-olu (ppkt 4.2.4). Przepłukać każdą kolbę wodą w ilości 3-5 ml, a następnie dolać tę wodę do rozdzielaczy. Potrząsać energicznie mieszaniną przez dokładnie 30 sekund. Pozostawić do rozdzielenia.

4.4.4.3. Należy oddzielić fazę butan-1-olu do naczynek pomiarowych (ppkt 4.3.2), używając filtru rozdzielania faz.

Może również zostać zastosowane wirowanie (3.000 g_n przez pięć minut).

4.4.4.4. Zmierzyć gęstość optyczną A₁ ekstraktu roztworu próbki z ppkt 4.4.1. przy 410 nm w porównaniu z ekstraktem roztworu odniesienia ppkt 4.4.2.

4.4.4.5. Podobnie zmierzyć ekstrakt roztworu do ślepej próby z ppkt 4.4.3 w porównaniu z butan-1-olem (A₂).

Uwaga: Wszystkie czynności muszą być wykonane w ciągu 25 minut od chwili umieszczenia kolb stożkowych Erlenmeyera w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.

4.4.5. Krzywa kalibracyjna

4.4.5.1. W 50 ml kolbie stożkowej Erlenmayera umieścić:

- 5,00 ml rozcieńczonego standardowego roztworu (ppkt 4.2.15),

- 5,00 ml pentano-2,4-dionu (ppkt 4.2.12),

- uzupełnić wodą demineralizowaną do końcowej objętości 30 ml.

4.4.5.2. Dalej postępować według wskazówek przedstawionych w ppkt 4.4.4, zmierzyć gęstość optyczną w porównaniu z butan-1-olem (ppkt 4.2.4).

4.4.5.3. Powtórzyć operację z 10, 15, 20 i 25 ml rozcieńczonego roztworu standardowego (ppkt 4.2.15).

4.4.5.4. Dla otrzymania wartości zerowej (odnoszącą się do barwy odczynników) postępować jak w ppkt 4.4.4.5.

4.4.5.5. Wykreślić krzywą kalibracyjną po odjęciu wartości zerowej od każdej gęstości optycznej otrzymanej w ppkt 4.4.5.1 i 4.4.5.3. Prawo Beera obowiązuje do 30 μg formaldehydu.

4.5. Obliczenia

4.5.1. Należy odjąć wartość A₂ od A₁ i odczytać z krzywej kalibracyjnej ilość C w mikrogramach formaldehydu w roztworze próbki (ppkt 4.4.1).

4.5.2. Należy obliczyć zawartość formaldehydu w próbce (% m/m) za pomocą następującego wzoru:

zawartość formaldehydu w

gdzie:

m = masa próbki analitycznej w g.

4.6. Powtarzalność⁽¹⁾

W przypadku zawartości formaldehydu w ilości 0,2 % różnica w wynikach dwóch równoległych oznaczeń, wykonanych na tej samej próbce, w metodzie kolorymetrycznej z pentano-2,4-dionem nie może przekraczać 0,005 %.

Jeśli oznaczenie wolnego formaldehydu prowadzi do wyników wyższych niż maksymalne stężenia przedstawione w dyrektywie (EWG) nr 76/768, tj.:

a) między 0,05 % a 0,2 % w nieoznakowanym produkcie;

b) lub gdy stężenie przekroczy 0,2 %, to bez względu na to, czy jest to produkt oznakowany, czy nie,

należy zastosować procedurę opisaną w pkt 5 poniżej.

5. OZNACZANIE W OBECNOŚCI DONORÓW FORMALDEHYDU.

5.1. Zasada

Oddzielny formaldehyd w reakcji z pentano-2,4-dionem przekształca się w żółtą pochodną lutydyny w reaktorze post-kolumnowym; pochodną tę można wykryć za pomocą gęstości optycznej przy 420 nm.

5.2. Odczynniki

Wszystkie odczynniki powinny być analitycznej czystości, a woda zaś musi być demineralizowana.

5.2.1. Woda jakości HPLC lub woda porównywalnej jakości;

5.2.2. Bezwodny octan amonu;

5.2.3. Stężony kwas octowy;

5.2.4. Pentano-2,4-dion (przechowywany w temp. 4 °C);

5.2.5. Bezwodny fosforan disodowy;

5.2.6. 85 % kwas ortofosforowy (d = 1,7);

5.2.7. Metanol o jakości HPLC;

5.2.8. Dichlorometan;

5.2.9. Formaldehyd o stężeniu masowym 37-40 %;

5.2.10. Wodorotlenek sodu, 1 M;

5.2.11. Kwas solny, 1 M;

5.2.12. Kwas solny, 0,002 M;

5.2.13. Świeżo przygotowany roztwór skrobi, przygotowany zgodnie z Europejską Farmakopeą (patrz ppkt 4.2.8);

5.2.14. Standardowy roztwór jodu, 0,05 M;

5.2.15. Standardowy roztwór tiosiarczanu sodu, 0,1 M;

5.2.16. Faza ruchoma:

Wodny roztwór fosforanu disodu (ppkt 5.2.5), 0,006 M o pH ustawionym za pomocą kwasu ortofosforowego (ppkt 5.2.6) do 2,1;

5.2.17. Odczynniki post-kolumnowe:

W kolbie miarowej o objętości 1.000 mm należy rozpuścić:

- 62,5 g octanu amonu (ppkt 5.2.2),

- 7,5 ml kwasu octowego(ppkt 5.2.3),

- 5 ml pentano-2,4-dionu (ppkt 5.2.4).

Należy dopełnić wodą do 1.000 ml (ppkt 5.2.1).

Ten odczynnik musi być chroniony przed światłem.

Czas zachowania: maksymalnie 3 dni w temp. 25 °C.

Kolor nie powinien ulec zmianie;

5.2.18. Standardowy formaldehyd: roztwór podstawowy

Należy wlać 10 g formaldehydu (ppkt 5.2.9) do kolby miarowej o objętości 1.000 ml i dopełnić wodą do 1.000 ml.

Należy oznaczyć stężenie roztworu w następujący sposób:

Odlać 5,00 ml; dodać 25,00 ml standardowego roztworu jodu (ppkt 5.2.14) oraz 10,00 ml roztworu wodorotlenku sodu (ppkt 5.2.10).

Odstawić na pięć minut.

Zakwasić 11,00 ml kwasu solnego (ppkt 5.2.11), po czym miareczkować nadmiar standardowego roztworu sodu roztworem tiosiarczanu sodu (ppkt 5.2.15) z użyciem roztworu skrobi (ppkt 5.2.13) jako wskaźnika.

1 ml roztworu jodu (ppkt 5.2.14) jest równoważny 1,5 mg formaldehydu;

5.2.19. Standardowy formaldehyd: roztwór rozcieńczony

Należy rozcieńczyć roztwór podstawowy do jednej setnej jego pierwotnego stężenia w fazie ruchomej (ppkt 5.2.16).

1 ml roztworu zawiera ok. 37 mg formaldehydu.

Należy obliczyć dokładną zawartość.

5.3. Aparatura

5.3.1. Standardowe wyposażenie laboratoryjne;

5.3.2. Bezpulsacyjna pompa HPLC;

5.3.3. Niskociśnieniowa bezpulsacyjna pompa do odczynników (lub druga pompa HPLC);

5.3.4. Zawór wtryskowy z 10 μl pętlą;

5.3.5. Reaktor postkolumnowy powinien być wyposażony w:

+ jedną 1-litrową kolbę o trzech szyjkach,

+ jeden 1-litrowy ogrzewacz do kolb,

+ dwie kolumny Vigreux z przynajmniej 10 płytami, z których dwie powinny być chłodzone powietrzem,

+ nierdzewną rurę stalową (do odprowadzania ciepła) 1,6 mm o średnicy wewnętrznej 0,23 mm, długości = 400 mm,

+ rurę teflonową 1,6 mm o średnicy wewnętrznej 0,30 mm, długości 5 m ((francuskie szycie) patrz dodatek 1),

+ jeden trójnik bez martwej objętości (Valco lub odpowiednik),

+ trzy złączki bez żadnych martwych objętości,

Lub: jeden moduł post-kolumnowy Applied Biosystems PCRS 520 lub odpowiednik wyposażony w 1-ml reaktor;

5.3.6. Filtr membranowy, o rozmiarze porów 0,45 μm;

5.3.7. Zasobnik SEP-PAK^R C₁₈ lub odpowiednik;

5.3.8. Kolumny gotowe do użytku:

- typu Bischoff hypersil RP 18 (typu NC odnośnik C 25.46 1805)

(5 μm, długość = 250 mm, średnica wewnętrzna = 4,6 mm),

- lub Dupont, Zorbax ODS

(5 μm, długość = 250 mm, średnica wewnętrzna = 4,6 mm),

- lub Phase SEP, spherisorb ODS 2

(5 μm, długość = 250 mm, średnica wewnętrzna = 4,6 mm);

5.3.9. Przed kolumną

typu Bischoff K₁ hypersil RP 18 (odnośnik K1 G 6301 1805)

(5 μm, długość = 10 mm, lub odpowiednik);

5.3.10. Kolumna z kolumną wstępną połączone są za pomocą systemu Ecotube (odnośnik A 15 020 508 Bischoff) lub odpowiednik.

5.3.11. Należy złożyć aparaturę (ppkt 5.3.5) tak, jak to przedstawiono na schemacie blokowym w dodatku 2.

Połączenia za zaworem wtryskowym muszą być możliwie krótkie. W tym przypadku nierdzewna stalowa rura między wyjściem reaktora a wejściem detektora będzie pełniła rolę chłodnicy mieszaniny przed detekcją, temperatura wewnątrz reaktora będzie nieznana, ale stała;

5.3.12 Detektor widzialnego promieniowania UV;

5.3.13 Rejestrator;

5.3.14. Wirówka;

5.3.15 Kąpiel z użyciem ultradźwięków;

5.3.16 Mieszadło wibracyjne (vortex lub odpowiednik).

5.4. Procedura

5.4.1. Krzywa kalibracyjna

Tworzy się ją dzięki nanoszeniu wartości szczytowych jako funkcji stężenia: rozcieńczonego formaldehydu do roztworu odniesienia formaldehydu.

Należy przygotować roztwory standardowe poprzez rozcieńczenie roztworu odniesienia (ppkt 5.2.19) fazą ruchomą (ppkt 5.2.16):

- 1,00 1 ml roztworu (ppkt 5.2.19) rozpuszczonego w 20,00 ml (ok. 185 μg/100ml),

- 2, 00 ml roztworu (ppkt 5.2.19) rozpuszczonego w 20,00 ml (ok. 370 μg/100ml),

- 5,00 ml roztworu (ppkt 5.2.19) rozcieńczonego w 25, 00 ml (ok. 740μg/100 ml),

- 5,00 ml roztworu (ppkt 5.2.19) rozcieńczonego w 20,00 ml (ok. 925 μg/100 ml).

Roztwory standardowe są przechowywane przez godzinę w temperaturze laboratoryjnej i muszą być świeżo przygotowane.

Liniowość krzywej kalibracyjnej jest prawidłowa dla stężeń między 1,00 a 15,00 μg/ml.

5.4.2. Przygotowanie próbek

5.4.2.1. Emulsje (kremy, podkłady do makijażu, kredki do oczu)

Do zamkniętej 100 ml kolby należy odważyć z dokładnością do 0,001 g ilość próbki analitycznej (mg) odpowiadającej przypuszczalnie ilości 100 μg formaldehydu. Następnie należy dodać 20,00 ml dichlorometanu (ppkt 5.2.8) oraz 20,00 ml dokładnie odmierzonego kwasu solnego (ppkt 5.2.12). Należy wymieszać składniki za pomocą mieszadła wibrującego (ppkt 5.3.16) oraz kąpieli ultradźwiękowej (ppkt 5.3.15), a następnie oddzielić dwie fazy poprzez wirowanie (3.000 gⁿ przez dwie minuty). W międzyczasie należy oczyścić zasobnik (ppkt 5.3.7) 2 ml metanolu (ppkt 5.2.7), po czym przystosować zasobnik 5 ml wody (ppkt 5.2.1).

Przepuścić 4 ml fazy płynnej ekstraktu przez przystosowany zasobnik, odrzucić pierwsze 2 ml, a następnie odzyskać następującą po tym frakcję.

5.4.2.2. Balsamy, szampony

Do zamkniętej kolby o objętości 100 ml odważyć z dokładnością do 0,001 g ilość próbki analitycznej (mg) odpowiadającej przypuszczalnie ok. 500 μg formaldehydu.

Dopełnić fazą ruchomą do 100 ml (ppkt 5.2.16).

Przepuścić roztwór przez filtr (ppkt 5.3.6) i wprowadzić lub przepuścić przez przystosowany jak poprzednio zasobnik (ppkt 5.4.2.1).Wszystkie roztwory muszą zostać wprowadzone bezpośrednio po przygotowaniu.

5.4.3. Warunki chromatografii:

- Prędkość przepływu fazy ruchomej: 1 ml/min,

- Prędkość przepływu odczynników: 0,5 ml/min,

- Całkowita prędkość przepływu u wyjścia detektora: 1,5 ml/min,

- Wprowadzona objętość: 10 μl,

- Temperatura elucji: W przypadku utrudnionego oddzielania zanurzyć kolumnę w kąpieli z topniejącego lodu: poczekać 15-20 min zanim temperatura się ustabilizuje,

- Temperatura reakcji w postkolumnie: 100 °C,

- Detekcja: przy 420 nm.

Uwaga: Cały system do chromatografii oraz postkolumna po użyciu muszą być przepłukane wodą (ppkt 5.2.1). Jeśli urządzenia są nieużywane przez więcej niż dwa dni, po przepłukaniu wodą należy przepłukać aparaturę metanolem (ppkt 5.2.7). Przed ponownym przystosowaniem systemu, w celu uniknięcia rekrystalizacji, należy przepuścić przez system wodę.

5.5. Obliczenia

Emulsje: (ppkt 5.4.2.1):

Zawartości formaldehydu w% (m/m):

Balsamy, szampony:

W tym przypadku stosuje się wzór zmieniony w następujący sposób:

gdzie:

m = masa badanej próbki w g (ppkt 5.4.2.1),

C = koncentrat formaldehydu w μg/100 ml odczytany z krzywej kalibracyjnej (ppkt 5.4.1.).

5.6. Powtarzalność⁽¹⁾

Dla 0,05 % zawartości formaldehydu różnica między wynikami dwóch oznaczeń w równolegle przeprowadzonych pomiarach tej samej próbki nie powinna przekraczać 0,001 %.

Dla 0,2 % zawartości formaldehydu różnica między wynikami dwóch oznaczeń w równolegle przeprowadzonych pomiarach tej samej próbki nie powinna przekraczać 0,005 %.

______

⁽¹⁾ ISO 5725.

DODATEK  1

INSTRUKCJE PRZYGOTOWANIA PRZYRZĄDU DO "FRANCUSKIEGO SZYCIA"

WYMAGANE AKCESORIA

– Jedna drewniana szpula:

o średnicy zewnętrznej 5 cm z otworem o średnicy 1,5 cm przechodzącym przez środek. Wstawić 4 stalowe gwoździe (jak pokazano na rysunkach 1 i 2). Odległość między dwoma gwoździami musi wynosić 1,8 cm, muszą być one oddalone o 0,5 cm od otworu,

– jedna sztywna igła (typu hakowego) do tworzenia pętli rurki teflonowej,

– rurka teflonowa 1,6 mm o długości pięciu metrów i średnicy wewnętrznej 0,3 mm.

PROCEDURA

Aby rozpocząć "francuskie szycie" za pomocą przyrządu, należy przeprowadzić rurkę teflonową od góry do dołu szpuli przez jej środkowy otwór (pozostawiając około 10 cm rurki odstające od spodu szpuli, aby umożliwić przeciągnięcie łańcucha w procesie tkania); następnie należy zawinąć rurkę kolejno o cztery gwoździe, jak pokazano na rysunku. 3.

Wejście i wyjście przyrządu ochraniane jest metalowymi zaciskami i śrubami zaciskowymi; należy uważać, aby nie uszkodzić teflonu przy silnym pociągnięciu. Zawinąć rurkę wokół każdego gwoździa po raz drugi i wykonać "ściegi" w następujący sposób:

– za pomocą sztywnej igły unieść rurkę z niższego rzędu nad rurkę z górnego rzędu (patrz rysunek 4). Czynność tę powtórzyć na każdym z gwoździ w kolejności (1, 2, 3, 4 w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara), aż do uzyskania łańcuszka o długości 5 m lub do uzyskania pożądanej długości.

Należy pozostawić około 10 cm w celu zamknięcia łańcucha. W celu zakończenia łańcucha należy przeprowadzić rurkę przez każde z czterech pętli i pociągnąć delikatnie.

Uwaga: Przyrządy do tkania "łańcucha" wytwarzane dla zastosowania w reaktorach postkolumnowych dostępne są na rynku (Supelco).

grafika

DODATEK  2

grafika

V.

OZNACZANIE REZORCYNY W SZAMPONACH I PŁYNACH DO WŁOSÓW

1. CEL I ZAKRES

Podaną metodą chromatografii gazowej oznacza się rezorcynę w szamponach i płynach do włosów. Metoda jest odpowiednia dla stężeń 0,1-2,0% w masie próbki.

2. DEFINICJA

Zawartość rezorcyny w próbce określona tą metodą jest wyrażana w procentach masowych.

3. ZASADA

Rezorcynę i 3,5-dwuhydroksytoluen (5-metylorezorcyna), dodawane jako standard wewnętrzny, wydziela się z próbki metodą chromatografii cienkowarstwowej. Oba związki są izolowane przez zdrapywanie ich plam z płytki cienkowarstwowej i ekstrahowanie metanolem. Na zakończenie ekstrahowane związki suszy się, sililuje i oznacza metodą chromatografii gazowej.

4. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki muszą być czyste do analizy.

4.l. Kwas chlorowodorowy, 25 % (m/m)

4.2. Metanol

4.3. Etanol, 96 % (v/v)

4.4 Gotowe płytki do chromatografii cienkowarstwowej (TLC), pokryte żelem krzemionkowym, ze sztucznego tworzywa lub aluminiowe, ze wskaźnikiem fluorescencyjnym. Dezaktywację przeprowadza się w następujący sposób: spryskiwać wodą standardowe płytki, pokryte żelem krzemionkowym do chwili, gdy staną się szkliste. Pozostawić spryskane płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na jedną do trzech godzin.

Uwaga

Jeśli płytki nie zostaną dezaktywowane, mogą wystąpić straty rezorcyny na skutek nieodwracalnej adsorpcji na żelu krzemionkowym.

4.5. Roztwór rozwijający; aceton - chloroform - kwas octowy (20:75:5 obj.).

4.6 Standardowy roztwór rezorcyny: rozpuścić 400 mg rezorcyny w 100 ml 96-procentowego etanolu (4.3) (1 ml odpowiada 4.000 μg rezorcyny).

4.7 Roztwór standardu wewnętrznego: rozpuścić 400 mg 3,5-dwuhydroksytoluenu (DHT) w 100 ml 96-procentowego etanolu (4.3) (1 ml odpowiada 4.000 μg DHT).

4.8 Mieszanina standardowa; zmieszać 10 ml roztworu 4.6 i 10 ml roztworu 4.7 w 100-mililitrowej kolbie miarowej, uzupełnić 96-procentowym etanolem (4.3) do kreski i wymieszać (1 ml odpowiada 400 μg rezorcyny i 400 μg DHT).

4.9 Środki sililujące:

4.9. l. N, O-bis-(trójmetylosililo)-trójfluoroacetamid (BSTFA)

4.9.2. Heksametylodwusilazan (HMDS)

4.9.3. Trójmetylochlorosilan (TMCS).

5. APARATURA

5.1. Zwykłe wyposażenie do chromatografii cienkowarstwowej i gazowej

5.2. Szkło laboratoryjne

6. PROCEDURA

6.1. Przygotowanie próbki

6.1.1. Zważyć dokładnie do 150-mililitrowej zlewki próbkę analityczną (m gramów) produktu, która zawiera około 20 do 50 mg rezorcyny.

6.1.2. Zakwaszać kwasem solnym (4.1) do momentu, kiedy mieszanina stanie się kwaśna (średnio potrzeba 2 do 4 ml), dodać 10 ml (40 mg DHT) roztworu standardowego wewnętrznego (4.7) i wymieszać. Przenieść do 100-mililitrowej kolby miarowej z etanolem (4.3), uzupełnić do kreski etanolem i wymieszać.

6.1.3. Nanieść 250 μl roztworu (6.l.2) na dezaktywowaną płytkę z żelem krzemionkowym (4.4) w formie ciągłej linii o długości około 8 cm. Należy zadbać o to, aby linia była możliwie jak najwęższa.

6.1.4. Nanieść 250 μl mieszaniny standardowej (4.8) na tę samą płytkę, w taki sam sposób jak w punkcie (6.1.3).

6.1.5. Nakropić w dwóch punktach linii początkowej po 5 μl każdego z roztworów 4.6 i 4.7, w celu łatwiejszego umiejscowienia po rozwinięciu płytki.

6.1.6. Rozwijać płytkę w komorze pozbawionej podkładu (nienasyconej), wypełnionej rozpuszczalnikiem rozwijającym 4.5, do momentu, w którym czoło rozpuszczalnika osiągnie linię w odległości 12 cm od linii początkowej; zwykle trwa to około 45 minut. Wysuszyć płytkę na powietrzu i umiejscowić strefę rezorcyny/DHT w świetle nadfioletowym o krótkich falach (254 nm). Oba związki mają w przybliżeniu te same wartości R_f. Oznaczyć pasma ołówkiem, w odległości 2 mm od zewnętrznej linii brzegowej pasm. Usunąć te strefy z płytki i zebrać adsorbent z każdego pasma do kolby 10-mililitrowej.

6.1.7. Ekstrahować adsorbent zawierający próbkę i adsorbent zawierający mieszaninę standardową w następujący sposób:

dodać 2 ml metanolu (4.2) i ekstrahować przez godzinę, nieustannie mieszając. Przesączyć mieszaninę i powtórzyć ekstrakcję przez kolejne 15 minut z 2 ml metanolu.

6.1.8. Połączyć ekstrakty i odparować rozpuszczalnik, susząc przez noc w eksykatorze zawierającym odpowiedni środek suszący. Nie stosować ogrzewania.

6.1.9. Sililować pozostałości (6.1.8) stosownie do wskazówek w punktach 6.l.9.l lub 6.l.9.2.

6.l.9.l. Dodać 200 μl BSTFA (4.9.l) mikrostrzykawką i pozostawić mieszaninę w zamkniętym naczyniu na 12 godzin, w temperaturze pokojowej.

6.1.9.2. Dodać kolejno 200 μl HMDS (4.9.2) i 100 μl TMCS (4.9.3) mikrostrzykawką i ogrzewać mieszaninę przez 30 minut, w temperaturze 60°C, w zamkniętym naczyniu. Mieszaninę schłodzić.

6.2. Chromatografia gazowa

6.2.1. Warunki chromatograficzne

Kolumna musi mieć zdolność rozdzielczą R równą lub większą niż 1,5, gdzie:

gdzie:

r₁ i r₂ = czasy retencji w minutach dwóch pików,

w₁ i w₂ = szerokość tych dwóch pików w połowie wysokości w mm,

d' = szybkość przesuwu papieru w mm na minutę.

Następujące kolumny i warunki chromatografii gazowej uznano za odpowiednie:

Kolumna		materiał:		stal nierdzewna
		długość:		200 cm
		średnica wewnętrzna:		~ 3
		wypełnienie:		10 % OV-17 na Chromosorbie WAW 100 do 120 oczek mm
Detektor płomieniowo-jonizacyjny
Temperatury:
kolumna:			185 °C (izotermiczna)
detektor:			250 °C
dozownik:			250 °C
Gaz nośny:			azot
Przepływ:			45 ml/min.

Dla ustawienia przepływów wodoru i powietrza należy przestrzegać instrukcji producenta.

6.2.2. Wprowadzić strzykawką 1 do 3 μl roztworów otrzymanych w punkcie 6.1.9 do chromatografu gazowego. Wykonać pięć iniekcji dla każdego roztworu (6.1.9), zmierzyć powierzchnię pików, obliczyć średnią wartość i stosunek powierzchni pików: S = powierzchnia piku rezorcyny/powierzchnia piku DHT.

7. OBLICZENIE

Stężenie rezorcyny w próbce, w procentach masowych (% m/m), jest wyrażone wzorem:

gdzie:

M = próbka analityczna w gramach (6.1.1),

S _próbki = średni stosunek powierzchni pików według 6.2.2 dla roztworu próbki,

S _{mieszaniny standardowej} = średni stosunek powierzchni pików według 6.2.2 dla mieszaniny standardowej.

8. POWTARZALNOŚĆ⁽¹⁾

Dla zawartości rezorcyny około 0,5 % różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie powinna przekroczyć wartości absolutnej 0,025 %.

VI.

OZNACZANIE METANOLU W STOSUNKU DO ETANOLU LUB PROPAN-2-OLU

1. CEL I ZAKRES

Metoda opisuje analizę metanolu metodą chromatografii gazowej we wszystkich produktach kosmetycznych (łącznie z aerozolowymi).

Oznaczać można względne poziomy stężeń 0-10 %.

2. DEFINICJA

Zawartość metanolu oznaczana tą metodą wyrażana jest w procentach masowych metanolu w stosunku do etanolu lub propan-2-olu.

3. ZASADA

Oznaczanie wykonuje się metodą chromatografii gazowej.

4. ODCZYNNIKI

Należy używać odczynników czystych do analizy.

4.1. Metanol

4.2. Absolutny etanol

4.3. Propan-2-ol

4.4. Chloroform, wolny od alkoholi poprzez przemycie wodą

5. APARATURA

5.1. Chromatograf gazowy:

z detektorem katarometrycznym dla próbek aerozoli,

z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym dla próbek nieaerozolowych.

5.2. Kolby miarowe, 100 ml

5.3. Pipety, 2 ml, 20 ml, 0-l ml

5.4. Mikrostrzykawki 0 do 100 μl i 0 do 5 μl

oraz (tylko dla próbek aerozolowych) specjalne gazoszczelne strzykawki z zaworem suwakowym (patrz: procedura pobierania próbek, rysunek 5⁽²⁾.

6. PROCEDURA

6.l. Przygotowanie próbek

6.1.1. Próbki wyrobów aerozolowych przygotowuje się zgodnie z przepisami rozdziału II załącznika do dyrektywy Komisji 80/1335/EWG z dnia 22 grudnia 1980 r⁽²⁾, a następnie poddaje się je analizie metodą chromatografii gazowej, w warunkach przedstawionych w punkcie 6.2.1.

6.1.2. Próbki wyrobów nieaerozolowych, przygotowane zgodnie z wymienionym powyżej rozdziałem II, rozcieńcza się wodą do poziomu stężenia od 1 do 2 % etanolu lub propan-2-olu, a następnie poddaje się je analizie metodą chromatografii gazowej, w warunkach przedstawionych w punkcie 6.2.2.

6.2 Chromatografia gazowa

6.2.1. Dla próbek aerozolowych używa się detektora katarometrycznego.

6.2.1.1. Wypełnienie kolumny: 10 % Hallcomid M 18 na Chromosorbie WAW, 100 do 200 mesh.

6.2.1.2. Kolumna musi mieć zdolność rozdzielczą R równą lub większą niż 1,5, gdzie:

gdzie:

r₁ i r₂ = czasy retencji w minutach dla dwóch pików,

w₁ i w₂ = szerokość tych dwóch pików w połowie wysokości,

d' = szybkość przesuwu papieru w mm na minutę.

6.2.1.3. Na uzyskanie tej rozdzielczości pozwalają następujące warunki:

Kolumna	materiał:		stal nierdzewna
	długość:		3,5 metrów
	średnica:		3 mm
Natężenie prądu mostka katarometru			150 mA,
Gaz nośny			hel
ciśnienie			2,5 bar
przepływ			45 ml/min
Temperatury:
dozownik:			150 °C
detektor:			150 °C
piec kolumny:			65 °C

Dokładność pomiarów powierzchni pików można poprawić poprzez zastosowanie całkowania elektronicznego.

6.2.2. Dla próbek nieaerozolowych:

6.2.2.l. Kolumnę wypełnia się: Chromosorb 105 lub Porapak QS, oraz stosuje się detektor płomieniowo-jonizacyjny.

6.2.2.2. Kolumna musi mieć zdolność rozdzielczą R równą lub większą niż 1,5 gdzie:

r₁ i r₂ = czasy retencji w minutach dla dwóch pików,

w₁ i w₂ = szerokości tych dwóch pików w połowie wysokości w mm,

d' = szybkość przesuwu papieru w mm na minutę.

6.2.2.3. Tę rozdzielczość uzyskano w następujących warunkach:

Kolumna:	materiał	stal nierdzewna
	długość:	2 metry
	średnica:	3 mm
Czułość elektrometru:		8 × 10-10 A
Gazy:
nośnik:		azot
ciśnienie:		2,1 bar
przepływ:		40 ml/min
Gaz pomocniczy:		wodór
ciśnienie:		1,5 bar
przepływ:		20 ml/min
Temperatury:
dozownik:		150 °C
detektor:		230 °C
piec kolumny:		120-130 °C

7. STANDARDOWY WYKRES

7.1. W celu wykonania analizy metodą chromatografii gazowej według 6.2.1 (kolumna Hallcomid M 18) należy stosować poniższe mieszaniny standardowe. Mieszaniny przygotowuje się przez odmierzenie pipetami, lecz należy ustalić dokładną ilość składnika przez bezpośrednie zważenie pipety lub kolby po każdym dodaniu składnika.

Stężenie względne (m/m%)	Metanol (ml)	Etanol lub propan-2-ol (ml)	Chloroform dodany do objętości (ml)
w przybliżeniu 2,5 %	0,5	20	100 ml
w przybliżeniu 5,0 %	1,0	20	100 ml
w przybliżeniu 7,5 %	1,5	20	100 ml
w przybliżeniu 10,0 %	2,0	20	100 ml

Wprowadzić 2 do 3 μl do chromatografu, stosując warunki podane w punkcie 6.2.1.

Obliczyć stosunek powierzchni pików (metanol/etanol) lub (metanol/propan-2-ol) dla wszystkich mieszanin.

Wykreślić standardowy wykres z użyciem oznaczeń:

oś X: %metanolu w stosunku do etanolu lub propan-2-olu,

oś Y: stosunek powierzchni pików (metanol/etanol) lub (metanol/propan-2-ol).

7.2. W celu wykonania analizy metodą chromatografii gazowej według punktu 6.2.2 (kolumna Porapak QS lub Chromosorb 105), należy stosować poniższe mieszaniny standardowe. Mieszaniny przygotowuje się przez odmierzanie mikrostrzykawką i pipetą, lecz należy ustalić dokładną ilość składnika przez bezpośrednie zważenie pipety lub kolby po każdym dodaniu składnika.

Stężenie względne (mm%)	Metanol (ml)	Etanol lub propan-2-ol (ml)	Woda dodana do objętości (ml)
w przybliżeniu 2,5 %	50	2	100 ml
w przybliżeniu 5,0 %	100	2	100 ml
w przybliżeniu 7,5 %	150	2	100 ml
w przybliżeniu 10,0 %	200	2	100 ml

Wprowadzić 2 do 3 μl do chromatografu, stosując warunki podane w punkcie 6.2.2.

Obliczyć stosunek powierzchni pików (metanol/etanol) lub (metanol/propan-2-ol) dla wszystkich mieszanin.

Wykreślić standardowy wykres z użyciem oznaczeń:

oś X: % metanolu w stosunku do etanolu lub propan-2-olu

oś Y: stosunek powierzchni pików (metanol/etanol) lub (metanol/propan-2-ol).

7.3. Standardowy wykres musi być linią prostą.

8. POWTARZALNOŚĆ⁽¹⁾

Dla zawartości metanolu 5 % w stosunku do etanolu lub propan-2-olu, różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie powinna przekraczać 0,25 %.

______

⁽¹⁾ Dz.U. L 383 z 31.12.1980, str. 27.

⁽²⁾ Patrz: norma ISO 5725.

1 Załącznik zmieniony przez art. 1 dyrektywy nr 90/207/EWG z dnia 4 kwietnia 1990 r. (Dz.U.UE.L.90.108.92) zmieniającej nin. dyrektywę z dniem 10 kwietnia 1990 r.

• Identyfikator: Dz.U.UE.L.1982.185.1
• Rodzaj: Dyrektywa
• Tytuł: Druga dyrektywa w sprawie zbliżenia ustawodawstw Państw Członkowskich odnoszących się do metod analizy niezbędnych do kontrolowania składu produktów kosmetycznych (82/434/EWG)
• Data aktu: 14/05/1982
• Data ogłoszenia: 30/06/1982
• Data wejścia w życie: 01/05/2004, 07/06/1982