Dotychczasowe metody analizy nie ułatwiały zadania: wymagały na przykład prób namnażania bakterii, co trwało nawet kilkadziesiąt godzin.

Nowa technika opracowana przez badaczy z Warszawy pozwala skrócić ten czas nawet do kwadransa.
- Jest to metoda niesamowicie szybka, a czas to jeden z kluczowych elementów istotnych przy detekcji wszelkiego rodzaju zakażeń bakteryjnych - mówi dr Agnieszka Kamińska Instytut Chemii Fizycznej PAN. A, jak dodaje, szybkie ustalenie gatunku bakterii umożliwia szybkie podjęcie leczenia.

- Opracowaliśmy nowatorskie podłoża, bazujące na matach polimerowych pokrytych złotem bądź srebrem, które posłużyły nam jednocześnie do filtracji bakterii ze złożonych układów biologicznych, czyli z moczu czy płynu mózgowo-rdzeniowego i mobilizacji nawet pojedynczych mikroorganizmów w określonym miejscu podłoża - tłumaczy dr Kamińska.

Do przeprowadzenia pomiaru jest potrzebna próbka płynu o objętości zaledwie mikrolitra, w której wystarczy znaleźć jedną bakterię, żeby zidentyfikować gatunek odpowiedzialny za rozwój choroby.

Przedstawiciele IChF PAN poinformowali, że w rozwiązaniu wykorzystano niezwykle czułą technikę analizy: wzmacnianą powierzchniowo spektroskopię ramanowską (SERS, czyli Surface-Enhanced Raman Spectroscopy).

We współpracy z Instytutem Fizyki PAN w Warszawie, IChF PAN opracował specjalne podłoża z tlenku cynku. Podłoża te wykorzystano do pomiarów metodą SERS stężeń pewnego związku - neopteryny w próbkach płynu mózgowordzeniowego. Próbki te - udostępnił je Narodowy Instytut Leków (NIL) w Warszawie - pochodziły od pacjentów z wcześniej zdiagnozowanym zapaleniem opon mózgowych. Okazało się, że w płynie mózgowym takich osób stężenie neopteryny było dziesięciokrotnie wyższe niż w próbce referencyjnej, pobranej od zdrowej osoby.

- Podwyższone stężenie neopteryny to cenna informacja, że organizm walczy z chorobą o podłożu bakteryjnym. Jednak zapalenie opon mózgowych może być efektem zakażenia różnymi gatunkami bakterii. Żeby działać naprawdę efektywnie, lekarz powinien wiedzieć, z którym gatunkiem ma właśnie do czynienia - podkreśla dr hab. Anna Skoczyńska, profesor NIL.

Pomiary widm ramanowskich bakterii w płynie mózgowo-rdzeniowym okazały się trudne: w przeciwieństwie do cząsteczek chemicznych, które nie przemieszczają się po podłożu, bakterie znajdują się w ciągłym ruchu. Przed naukowcami pojawiło się wyzwanie: należało opracować podłoża, które nie tylko zapewnią wzmocnienie sygnału ramanowskiego, ale także odfiltrują bakterie z płynu oraz skutecznie je unieruchomią na czas pomiaru.

Rozwiązaniem okazały się tanie, komercyjnie dostępne maty tkane, pokrywane w IChF PAN cienką warstwą stopu złota i srebra (jej grubość to około 70-80 nanometrów). Przez układ kilku takich mat, o malejących porach, przepuszczano strumień płynu mózgowo-rdzeniowego podawany przez pompę strzykawkową. Gdy bakteria docierała do maty o zbyt małych oczkach, grzęzła w jednym z nich, a odpowiednio dobrana prędkość przepływu strumienia płynu uniemożliwiała jej zmianę położenia.

- Przetestowaliśmy nasze podłoża na trzech gatunkach bakterii wywołujących zapalenie opon mózgowych: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae i Haemophilus influenzae. Poprawnie wykrywaliśmy ich obecność w 95 procentach przypadków, a gatunek identyfikowaliśmy z pewnością sięgającą 98 procent. A ponieważ mówimy o niezwykle czułej spektroskopii ramanowskiej, do otrzymania tak precyzyjnych wyników wystarczało nam znalezienie jednej komórki bakteryjnej - podkreśla dr Kamińska.

Cały przebieg analizy jest w znacznym stopniu zautomatyzowany i do minimum ogranicza kontakt laboranta z badaną próbką. W celu przeprowadzenia pomiaru należy jedynie pobrać pod wyciągiem laminarnym mikrolitrową porcję płynu mózgowo-rdzeniowego do strzykawki, a następnie tę umieścić w pompie strzykawkowej podłączonej do spektrometru Ramana. W celu zwiększenia pewności pomiaru zarejestrowane sygnały są przetwarzane przez oprogramowanie korzystające z zaawansowanych metod statystycznych i obsługującemu pozostaje jedynie odczytać wynik.

W stosunku do dotychczasowych metod, rozwiązanie zaproponowane przez IChF PAN ma szereg zalet: wymaga niewielkich ilości płynu mózgowo-rdzeniowego, eliminuje konieczność długotrwałego namnażania bakterii, automatyzacja pomiaru gwarantuje wysoki poziom bezpieczeństwa, a wynik jest dostępny w ciągu minut. Istotnym argumentem jest także cena: zakup sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia analizy nie przekracza kilkudziesięciu tysięcy dolarów, leży więc w zasięgu możliwości finansowych nawet małych placówek medycznych.(pap)